是臨床檢驗(yàn)發(fā)展最快的專業(yè)

將是應(yīng)用最廣的專業(yè)

方興未艾的專業(yè)

將是最具活力的專業(yè)

一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)

（一）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)計(jì)原則

（二）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向

（三）工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)。

二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作基本原則

三、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室各區(qū)域工作注意事項(xiàng)

關(guān)鍵點(diǎn)一、防污染意識(shí)和措施

PCR技術(shù)最令人頭痛的問題是污染，極其微量的污染即可造成假陽性的結(jié)果。如果形成氣溶膠污染擴(kuò)散，則可引起整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室的污染，處理起來非常棘手，甚至要關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室。

嚴(yán)格執(zhí)行各區(qū)功能劃分

1.試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。

2.標(biāo)本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。對(duì)于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。

3.擴(kuò)增區(qū)：cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測。

4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。

● 人：操作者、科主任、實(shí)習(xí)進(jìn)修生、保潔員、患者（家屬）……

● 工作流程：單一流向

● 操作規(guī)程：認(rèn)真對(duì)待每一個(gè)細(xì)節(jié)

進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→ 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用

不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。

實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染

工作結(jié)束后，必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔（次氯酸鈉）。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照射應(yīng)當(dāng)方便有效（可移動(dòng)紫外燈，254nm波長），在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60～90cm內(nèi)照射。

實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。

注意事項(xiàng)：

試劑盒中的陽性對(duì)照品及質(zhì)控品不應(yīng)當(dāng)保存在試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū) ，應(yīng)當(dāng)保存在標(biāo)本處理區(qū)。

由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，可通過在標(biāo)本制備區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件，避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管。

必須注意的是，所有經(jīng)過檢測的反應(yīng)管不得在擴(kuò)增區(qū)打開。

必須注意避免通過擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。

不規(guī)范操作案例：

陽性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品與試劑混放

1.試劑：出入庫、質(zhì)檢、使用記錄、自配試劑、高壓消毒器械、結(jié)論、署名

2.儀器：（電子天平、低溫冷凍高速離心機(jī)、水浴鍋、移液器、離心機(jī)、超凈臺(tái)、混勻器等）使用情況記錄、運(yùn)行狀況、結(jié)論（含校準(zhǔn)、維護(hù)保養(yǎng)、維修記錄，原始數(shù)據(jù)后附清單）

3.基本條件狀況：溫濕度、冰箱冷藏冷凍溫度（繪圖）、紫外燈照射累積時(shí)間（含超凈臺(tái)、傳遞窗和空氣消毒燈）、可移動(dòng)紫外燈照射累積時(shí)間及照射范圍、結(jié)論、署名

4.標(biāo)本：驗(yàn)收（含標(biāo)本性狀）、拒收及理由、特送標(biāo)本雙簽字

5.質(zhì)控（購買或自備、繪圖時(shí) X、SD、CV）

6. 實(shí)驗(yàn)過程記錄單/表：（見下方圖1、圖2）

7.報(bào)告：具體方法學(xué)（實(shí)時(shí)熒光定量/定性PCR）、標(biāo)本類型及性狀說明、唯一編號(hào)、陰陽性及定量、參考范圍/最低檢測限的確定、送檢時(shí)間（具體到時(shí)）、報(bào)告時(shí)間（具體到分）、備注（結(jié)果僅對(duì)此標(biāo)本負(fù)責(zé)。如有疑問，請(qǐng)于一周內(nèi)到PCR實(shí)驗(yàn)室查詢?。?/p>

8.抱怨記錄：應(yīng)有時(shí)間、事件（項(xiàng)目）、接待人、處理方法、處理結(jié)果、處理人簽字確認(rèn)。

SOP文件的現(xiàn)行有效性

儀器的標(biāo)識(shí)維護(hù)保養(yǎng)

試劑及耗品的質(zhì)檢

.室內(nèi)質(zhì)控

1.管理文件部分：

工作制度

各種管理程序文件

各項(xiàng)工作程序及流程、標(biāo)準(zhǔn)操作程序（ SOP）

各種表格（Tab-1……）

注意事項(xiàng)：

操作人員必須熟悉掌握本實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)工作制度及SOP文件。當(dāng)新版文件核準(zhǔn)使用后，應(yīng)將原文件及時(shí)收回。

一定做到：

寫你所做的

做你所寫的

記你所做的

分析所記的

改你分析的

2.關(guān)于標(biāo)識(shí)：

實(shí)驗(yàn)室名稱

各區(qū)名稱

入口出口說明

禁入標(biāo)識(shí)

單向說明及箭頭

生物防護(hù)標(biāo)識(shí)

生物防護(hù)垃圾袋

儀器運(yùn)行綠色標(biāo)簽【注意：a.要比較明顯的被看見、先考慮顯而易見、再考慮美觀 ?b.綠：正常運(yùn)行、黃：暫停、紅：停用】

重要儀器校驗(yàn)和檔案標(biāo)簽

記錄筆、紙、抹布、加樣器、槍頭盒等辦公用品各區(qū)不同顏色標(biāo)識(shí)標(biāo)簽

柜、凳標(biāo)識(shí)

可移動(dòng)儀器標(biāo)識(shí)

（可以）總的和各區(qū)的規(guī)章制度上墻、上門，重要儀器的操作流程卡上墻

1.儀器檔案

主要儀器應(yīng)有：

（a）放置地點(diǎn)；

（b）制造商名稱、型號(hào)、序號(hào)或其它唯一性標(biāo)識(shí)；

（c）儀器使用說明書或其復(fù)印件；

（d）校準(zhǔn)/檢測的日期和結(jié)果以及下次校準(zhǔn)和/或檢測的日期；

（e）迄今所進(jìn)行的維護(hù)和今后維護(hù)計(jì)劃的細(xì)節(jié)；

（f）損壞、故障、改裝或修理的歷史。

加樣器、溫度計(jì)、溫濕度計(jì)需出具計(jì)量局校正報(bào)告文件及復(fù)印件【可每品種有一套具備計(jì)量局的校正報(bào)告，并以此作為其它加樣器、溫濕度計(jì)的校正標(biāo)準(zhǔn)】【加樣器要有出廠編號(hào)、使用時(shí)間、校正記錄】

擴(kuò)增儀需有儀器廠家提供進(jìn)口醫(yī)療器械銷售使用許可證，安裝服務(wù)單、裝機(jī)單，儀器說明書及復(fù)印件，專業(yè)技術(shù)人員維護(hù)校正報(bào)告和校正后參數(shù)，儀器維護(hù)后驗(yàn)證記錄【用同一公司或校準(zhǔn)試劑或用自制質(zhì)控血清并記錄數(shù)值】

高速低溫冷凍離心機(jī)需出具計(jì)量局校正報(bào)告文件【轉(zhuǎn)速、溫度，校準(zhǔn)、擬下次校準(zhǔn)】

2.試劑檔案

醫(yī)療藥品生產(chǎn)許可證明，PCR試劑新藥證書，PCR試劑生產(chǎn)許可證，PCR試劑使用說明書，試劑廠商或銷售商的銷售許可證?！緫?yīng)有廠家或廠家授權(quán)銷售商的紅色印章】

3.人員和技術(shù)檔案

實(shí)驗(yàn)室主要負(fù)責(zé)人、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員名單

簡歷表、培訓(xùn)檔案，要求有實(shí)質(zhì)性文件【如每人的學(xué)歷證書及復(fù)印件、操作上崗證、科研成果（課題）、技術(shù)文章、獲獎(jiǎng)證書等的復(fù)印件?！?/p>

根據(jù)實(shí)際情況及時(shí)進(jìn)行增補(bǔ)。

關(guān)鍵點(diǎn)五、學(xué)習(xí)培訓(xùn)

基礎(chǔ)知識(shí)：如何設(shè)定閾值線？如何調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)曲線？

專業(yè)新進(jìn)展

報(bào)告結(jié)果的解釋

正確對(duì)待臨床和患者等方面的抱怨

關(guān)鍵點(diǎn)六、其他

報(bào)告單的審核與簽發(fā)：編號(hào)唯一性、項(xiàng)目完整性、書寫完整性

操作者和審核者有無PCR上崗資質(zhì)？

檢測結(jié)果的單位：

參考值/最低檢測限：定量報(bào)告

……

作者：馮忠軍

單位：河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科