一、細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)
１?簡(jiǎn)述
細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)是檢測(cè)非規(guī)定滅菌制劑及原、輔料受微生物污染程度的方法。也是用于評(píng)價(jià)生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)。
細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)均采用平板菌落計(jì)數(shù)法，這是活菌計(jì)數(shù)的方法之一，也是目前國(guó)際上許多國(guó)家常用的一種方法。以在瓊脂平板上的細(xì)菌、霉菌和酵母菌形成一個(gè)獨(dú)立可見(jiàn)的菌落為計(jì)數(shù)依據(jù)。該法測(cè)定結(jié)果只反映在該規(guī)定條件下所生長(zhǎng)的細(xì)菌（為一群嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)。不包括對(duì)營(yíng)養(yǎng)、氧氣、溫度、pH和其他因素有特殊要求的細(xì)菌、霉菌和酵母菌。
一個(gè)細(xì)菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一個(gè)或多個(gè)菌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而成。因此供試品中所測(cè)得的菌落數(shù)，實(shí)際為菌落形成單位數(shù)（colony forming unity，cfu），不應(yīng)理解為細(xì)菌、霉菌、酵母菌的個(gè)數(shù)。
2?設(shè)備、儀器
2.1?設(shè)備
2.1.1?潔凈實(shí)驗(yàn)室
微生物限度檢查應(yīng)有單獨(dú)的潔凈實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)潔凈實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有獨(dú)立的凈化空氣系統(tǒng)。
2.1.1.1?結(jié)構(gòu)和要求?潔凈實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采光良好、避免潮濕、遠(yuǎn)離廁所及污染區(qū)。操作間與緩沖間之間應(yīng)有樣品傳遞艙，出入操作間和緩沖間的門(mén)不應(yīng)直對(duì)。潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墻壁與地面、天花板連接處應(yīng)呈凹弧形，無(wú)縫隙，不留死角。操作間內(nèi)不應(yīng)安裝下水道。
潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的照明燈應(yīng)嵌裝在天花板內(nèi)，室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于300LX。
2.1.1.2?溫度、濕度?潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的溫度應(yīng)控制在18～26℃，相對(duì)濕度最好在40％～60％。
2.1.1.3?操作間?操作間應(yīng)安裝空氣除菌過(guò)濾層流裝置。潔凈度不應(yīng)低于10000級(jí)，局部潔凈度為100級(jí)（或放置同等級(jí)凈化工作臺(tái)）。操作間或凈化工作臺(tái)的潔凈空氣應(yīng)保持對(duì)環(huán)境形成正壓，不低于10Pa，操作間與緩沖間也應(yīng)保持相對(duì)正壓，不低于5Pa。操作臺(tái)上備有藥物天平，乙醇燈，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳頭等。
2.1.1.4?緩沖間?緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆和無(wú)菌衣、帽、口罩、鞋套等。
2.1.1.5?潔凈級(jí)別及檢查方法?通常采用塵粒數(shù)及浮游菌數(shù)或沉降菌數(shù)測(cè)定法（參照《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室》（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌、和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)）進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。
不同潔凈級(jí)別的微粒、浮游菌和沉降菌標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)下表1。
表l?不同潔凈級(jí)別的微粒、浮游菌和沉降菌標(biāo)準(zhǔn)
| 潔凈級(jí)別 | 塵埃數(shù)ㄍm3 | 浮游菌（個(gè)）ㄍm3 | 沉降菌（個(gè)）ㄍ
（φ90mm?0.5h） |
|
| 微粒直徑≥0.5μm | 微粒直徑≥5μm | |||
| 100級(jí) | ≤3，500 | ≤0 | ≤5 | ≤1 |
| 10000級(jí) | ≤350，000 | ≤2000 | ≤100 | ≤3 |
| 100000級(jí) | ≤3，500，000 | ≤20，000 | ≤500 | ≤10 |
沉降菌數(shù)測(cè)定（Ⅱ法）
潔凈實(shí)驗(yàn)室操作臺(tái)消毒擦拭處理后，先啟動(dòng)層流凈化裝置30min，將備妥的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板3個(gè)（經(jīng)30～35℃預(yù)培養(yǎng)48h，證明無(wú)菌落生長(zhǎng)）。以無(wú)菌方式（或經(jīng)傳遞箱）移人操作間，置凈化臺(tái)左、中、右各1個(gè)，開(kāi)蓋，暴露30min后將蓋蓋上。在30～35℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48h，取出檢查。3個(gè)平板生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)不超過(guò)1個(gè)。
有條件的單位，同時(shí)應(yīng)檢查潔凈操作間和凈化工作臺(tái)上的浮游菌和微粒數(shù)。
操作問(wèn)和凈化工作臺(tái)要定期檢測(cè)其潔凈度，分別應(yīng)達(dá)到10000級(jí)和100級(jí)。如菌落數(shù)或微粒數(shù)超標(biāo)，應(yīng)清洗過(guò)濾系統(tǒng)中的過(guò)濾設(shè)施，必要時(shí)予以更換。
2.1.1.6?在每次操作前、后用0.1％苯扎溴銨溶液或其他適宜消毒液擦拭操作臺(tái)及可能污染的死角，然后啟動(dòng)層流凈化裝置。
2.1.2?陽(yáng)性菌實(shí)驗(yàn)室
涉及實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控菌株的分離鑒定、樣品陽(yáng)性菌株的分離分析、方法驗(yàn)證試驗(yàn)中的陽(yáng)性菌操作等實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，應(yīng)在專門(mén)的陽(yáng)性菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。除另有規(guī)定外，陽(yáng)性菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國(guó)家Ⅱ級(jí)生物安全標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備生物安全柜。陽(yáng)性菌操作不得在供試品檢驗(yàn)用潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。
2.1.3?潔凈實(shí)驗(yàn)室、陽(yáng)性菌實(shí)驗(yàn)室與洗刷、滅菌、消毒、培養(yǎng)及結(jié)果觀察的工作間等設(shè)施應(yīng)相對(duì)集中，布局合理，避免污染，便于管理。
2.2?儀器
2.2.1?恒溫培養(yǎng)箱（30～35℃）、生化培養(yǎng)箱（23～28℃）、微波爐、勻漿儀（3000～8000 r／min）或康氏振蕩器、恒溫水浴、電熱干燥箱（100～300℃）、電冰箱、離心機(jī)、離心管、微孔濾膜及薄膜過(guò)濾器、蒸汽滅菌器（使用時(shí)要進(jìn)行滅菌效果檢查并應(yīng)定期請(qǐng)有關(guān)部門(mén)檢定）。
菌落計(jì)數(shù)器、顯微鏡（40×～1500×）、電子天平或藥物天平（感量0.1g），pH計(jì)。
2.2.2?玻璃器皿?錐形瓶（250～300ml、500ml內(nèi)裝玻璃珠若干）、培養(yǎng)皿（9cm）、量筒（100ml，500m1）、試管（18mm×180mm）及塞、吸管（1m1分度0.0l，10m1分度0.1）、注射器（20ml或30m1）、涂布棒、注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）、不銹鋼桶（帶蓋）。玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，吸管、量筒不掛水滴，無(wú)殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花，置吸管筒內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時(shí)，尚需用玻璃紙包裹瓶塞，以免振蕩時(shí)供試液污染瓶塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽121℃滅菌30min，烘干備用。
2.2.3?用具?大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70％～75％乙醇溶液浸泡）。無(wú)菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌，備用。也可用一次性無(wú)菌衣、帽、口罩、手套。
接種環(huán)（白銥金或鎳鉻合金，環(huán)徑4～5mm、長(zhǎng)度6～10cm）、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、白瓷盤(pán)、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）、實(shí)驗(yàn)記錄紙等。
3?試液、稀釋劑和試劑
3.1試液
3.1.1?0.1％苯扎溴銨溶液或其他適宜消毒液（供洗手、擦拭操作臺(tái)面用）。
3.1.2?5％石碳酸溶液（配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒帶菌吸管用）亦可選用其他適宜消毒液。
3.1.3?75％乙醇溶液。
3.1.4?碘酊或碘伏溶液。
3.2?稀釋劑和試劑
稀釋劑配制后，采用高壓蒸汽滅菌法滅菌。
3.2.1?0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液（附件二3.1）。
3.2.2?pH7.0無(wú)菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液（附件二3.5）。
3.2.3?無(wú)菌聚山梨酯80氯化鈉?蛋白胨緩沖液（附件二3.4）。
3.2.4?pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（附件二3.3）。
3.2.5?無(wú)菌聚山梨酯80氯化鈉溶液（附件二3.2）。
3.2.6?無(wú)菌0.1％氯化三苯四氮唑溶液（TTC）（附件二2.15）。
3.2.7?pH7.2無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（附件二3.3）。
4?培養(yǎng)基
4.1?營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.2）。
4.2?玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.4）。
4.3?酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.5）。
培養(yǎng)基制備注意事項(xiàng)：
4.3.1?采用干燥培養(yǎng)基，按說(shuō)明配制，應(yīng)對(duì)滅菌后的培養(yǎng)基pH進(jìn)行校驗(yàn)。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測(cè)定，以確定配制時(shí)瓊脂用量。試劑規(guī)格應(yīng)為化學(xué)純以上。
4.3.2?配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀。如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過(guò)濾，滅菌后使用。
4.3.3?培養(yǎng)基的分裝量不得超過(guò)容器的2／3，以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子必須塞緊，以免松動(dòng)或脫落造成染菌。
4.3.4?培養(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。
4.3.5?滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2～25℃，防止被污染，可在3周內(nèi)用畢；保存于密閉容器中，可在1年內(nèi)使用。制備好的培養(yǎng)基放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免水分散失及染菌。
4.3.6?宜采用用水浴或微波爐加熱熔化瓊脂培養(yǎng)基，勿用電爐直接熔化瓊脂培養(yǎng)基，以免營(yíng)養(yǎng)成份過(guò)度受熱而破壞。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng)8h內(nèi)一次用完，剩余培養(yǎng)基不宜再用。
4.4?培養(yǎng)基適用性實(shí)驗(yàn)的要求及操作見(jiàn)本操作規(guī)程第三部分。
5?供試品抽樣、保存及檢驗(yàn)量
5.1?抽樣
5.1.1?一般采用隨機(jī)抽樣方法，其抽樣量應(yīng)為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的3～5倍量（以備復(fù)試或留樣觀察）。
5.1.2?抽樣時(shí)，凡發(fā)現(xiàn)有異常或可疑的樣品，應(yīng)選取有疑問(wèn)的樣品。機(jī)械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。
5.1.3?凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周?chē)┩庥^看出長(zhǎng)螨、發(fā)霉、蟲(chóng)蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格品，無(wú)需再抽樣檢驗(yàn)。
5.2?保存
5.2.1?供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥致死，損傷或繁殖。
5.2.2?供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開(kāi)啟。包裝已開(kāi)啟的樣品不得作為供試品進(jìn)行檢查。
5.3?檢驗(yàn)量
5.3.1?所有劑型的檢驗(yàn)量均需取自2個(gè)以上包裝單位（中藥蜜丸需取自4丸、膜劑取4片以上）。
5.3.2?固體及半固體（黏稠性供試品）制劑檢驗(yàn)量為10g。
5.3.3?液體制劑檢驗(yàn)量為10ml。
5.3.4?膜劑除另有規(guī)定外，檢驗(yàn)量為100cm2。
5.3.5?特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗(yàn)量可酌減。除另有規(guī)定外，口服固體制劑不低于3g，液體制劑采用原液者不得少于6ml，采用供試液者不得少于3ml，外用藥品不得少于5g。
要求檢查沙門(mén)菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)）。
6?試驗(yàn)準(zhǔn)備
6.1?將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管（1ml、10m1）、量筒、稀釋劑等移至潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。每次試驗(yàn)所用物品必須事先做好計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中出入潔凈實(shí)驗(yàn)室。編號(hào)后將全部外包裝（牛皮紙）去掉。
6.2?開(kāi)啟潔凈實(shí)驗(yàn)室空氣過(guò)濾裝置，并使其工作不低于30min。
6.3?操作人員用肥皂或適宜消毒液洗手，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋。再用0.1％苯扎溴銨溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無(wú)菌衣、帽、口罩、手套。
6.4?操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開(kāi)口處周?chē)?，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或剪將供試品啟封。
7?供試液的制備
根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。所用乳化劑，分散劑、中和劑或滅活劑及其用量應(yīng)證明是有效的，并對(duì)微生物無(wú)毒性。供試液的制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過(guò)45℃，時(shí)間不得超過(guò)30min。除另有規(guī)定外，常用的供試品制備方法如下：
7.1?液體供試品?取供試品10ml，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為供試液。油劑可加入適量的無(wú)菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑可用混合的供試品原液作為供試液。
7.2?固體、半固體或黏稠液供試品?取供試品10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為供試液。必要時(shí)加適量的無(wú)菌聚山梨酯80，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。
7.3?非水溶性供試品
7.3.1?軟膏、乳膏劑?取供試品5g（或5m1），加至含溶化的（溫度不超過(guò)45℃）司盤(pán)805g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g的無(wú)菌混合物（溶化，溫度不超過(guò)45℃）的燒杯中，即先將燒杯中無(wú)菌助溶劑混合物溶化，待溫度不超過(guò)45℃時(shí)，加入供試品，用無(wú)菌玻棒攪拌成團(tuán)后，分次慢慢加入45℃的pH7.0無(wú)菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1:20供試液。
7.3.2?油劑?取供試品10ml，加入無(wú)菌聚山梨酯80 5～8ml，搖勻，再加入稀釋劑至100ml，作為1:10供試液。
7.3.3?栓劑?稱取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置45℃水浴保溫10min，使溶，加入無(wú)菌聚山梨酯80 5～8ml，振搖使之乳化，再加稀釋劑（稀釋劑和聚山梨酯80總量為100m1），搖勻，作為1:10供試液。
7.3.4?膏劑?取供試品10g，加至含20ml無(wú)菌十四烷酸異丙酯（制法見(jiàn)附錄ⅪH“無(wú)菌檢查法”)和無(wú)菌玻璃珠的適宜容器中，必要時(shí)可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然后加入45℃的pH7.0無(wú)菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液100m1，振搖5～10min，萃取，待油水明顯分層，取其水層作為1:10供試液。
7.4?非水溶性膜劑供試品?一般取樣為100cm2，置滅菌錐形瓶中，加入適量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液，于45℃±1℃水浴中保溫，浸泡，振搖，以供試品浸液作為l:10供試液。中藥膜劑取100cm2，剪碎，加適量的pH7.0無(wú)菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液（通常1 cm2加1ml或2m1），浸泡，振搖，以供試品浸液作為1:10供試液。
7．5?腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品?取供試品10g，腸溶制劑加pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml，結(jié)腸溶制劑加pH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml，均置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為1:10供試液。
7.6?氣霧劑、噴霧劑供試品?取規(guī)定量供試品，置冰箱冰凍室（－20℃以下）內(nèi)約1h。取出，迅速消毒供試品容器的開(kāi)啟部位周?chē)?，用無(wú)菌鋼錐在容器上鉆一小孔，在室溫輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器吸出全部藥液，加至適量的稀釋劑（若含非水溶性成份，加適量的無(wú)菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1:10的供試液。
7.7?茶劑供試品?取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖2～3min，以滅菌紗布過(guò)濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結(jié)果按1:10加稀釋劑，浸泡30min）。
以上供試品如吸水膨脹，或黏度過(guò)高，可增加稀釋劑的量，制成1:20～1:100供試液。
7.8?貼膏劑供試品?取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護(hù)層，放置在無(wú)菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無(wú)菌多孔材料（如無(wú)菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30min，或放置于均質(zhì)儀均質(zhì)l0min，或以其他方法制備成供試液。
7.9?具抑菌活性的供試品
當(dāng)供試品具有抑菌活性時(shí)，應(yīng)消除供試液的抑菌活性后，再依法檢查。常用的方法如下：
7.9.1?稀釋法?取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少至不具抑菌作用。用平板法測(cè)定菌數(shù)時(shí)，1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強(qiáng)的制劑。
7.9.2?離心沉淀法?此方法用于去除供試液中的沉淀物，對(duì)于抑菌活性較強(qiáng)的供試品，如供試液中有不溶顆粒、沉淀，取供試液，先以500 r／min，離心3min，取上清液進(jìn)行試驗(yàn)，此方法用于細(xì)菌計(jì)數(shù)和控制菌（細(xì)菌）檢查。
7.9.3?薄膜過(guò)濾法?見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)。
7.9.4?中和法?凡含汞、砷或防腐劑的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化、中和其抑菌活性，制成供試液。
8?供試液的釋?。?0倍遞增稀釋法）
8.1?取2～3支滅菌試管，分別加入9ml pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑（此時(shí)操作一般為：左手執(zhí)試管并將塞打開(kāi)，傾斜，右手執(zhí)10ml吸管吸量。切勿在酒精燈火焰的正上方操作，以免火焰將供試液中的菌細(xì)胞殺滅）。加稀釋劑后，試管塞應(yīng)立即塞上。
8.2?另取1支1ml滅菌吸管吸1:10均勻供試液1ml，加入裝有9ml pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑的試管中，混勻，即得1:100供試液。以此類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1:103、1:104等適宜稀釋級(jí)。每遞增l稀釋級(jí)，必須另?yè)Q一支吸管。
稀釋時(shí)，吸管插入第1級(jí)稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，反復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁調(diào)整液量至刻度，吸管移至第2級(jí)稀釋管的內(nèi)壁近液面處（勿接觸液面）緩慢地放出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無(wú)黏附或殘留液體），然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。
9?計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證
由于某些供試品具有抗菌活性，在建立測(cè)定方法或原測(cè)定法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對(duì)供試品的抑菌活性及測(cè)定方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。
9.1?驗(yàn)證用菌株大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102]，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CCMCC(B) 26003]，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[CMCC(B) 63501]，白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001]，黑曲霉菌Aspergillus niger[CMCC(F) 98003]。
菌液制備?接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml／m1）聚山梨酯80的0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，用適宜方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05％（ml／ml）聚山梨酯80的0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～l00cfu的孢子懸液。
菌懸液制備后，若在室溫下放置應(yīng)在2h內(nèi)使用，若保存在2～8℃的菌懸液可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉菌的孢子懸液保存在2～8℃，可在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)替代對(duì)應(yīng)量的新鮮孢子懸液使用。
9.2?驗(yàn)證方法?驗(yàn)證試驗(yàn)分4組，至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組和對(duì)照組試驗(yàn)的菌回收率。
9.2.1?供試品組?取最低稀釋級(jí)的供試液，按每1ml供試液加入50～l00cfu試驗(yàn)菌，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)菌液、供試液各1ml分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基；薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取供試液2ml過(guò)濾，沖洗液沖洗，并在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌。
9.2.2?活菌組?取上述試驗(yàn)菌液，測(cè)定其加入的試驗(yàn)菌菌數(shù)。
9.2.3?供試品對(duì)照組?取最低稀釋級(jí)的供試液1ml，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。
9.2.4?稀釋劑對(duì)照組?為考察供試液制備過(guò)程中對(duì)微生物影響的程度，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml含50～l00cfu，按供試品組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。
9.3?結(jié)果判定對(duì)照組的菌回收率均應(yīng)不低于70％。若供試品組的菌回收率均不低于70％，則可按該供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中供試品組的菌回收率低于70％，應(yīng)建立新的方法，消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。
9.4?驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。
9.5?注意事項(xiàng)
9.5.1?所用標(biāo)準(zhǔn)菌種的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代。以冷凍干燥的原始菌種開(kāi)啟后轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，其培養(yǎng)物為第一代。
9.5.2?黑曲霉菌的菌液制備?將黑曲霉菌接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于20～25℃培養(yǎng)5～7天，使大量的孢子產(chǎn)生。加入3～5ml含0.05％（ml／m1）聚山梨酯80的0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液，用無(wú)菌玻棒或接種環(huán)輕輕將孢子洗脫。然后可用一支l0ml無(wú)菌球形毛細(xì)吸管，其管口用無(wú)菌棉花或紗布包扎且能過(guò)濾菌絲的裝置，吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，將孢子懸液稀釋至每毫升含50～l00cfu。
9.5.3?做試驗(yàn)菌的回收率試驗(yàn)時(shí)，加入菌量50～l00cfu為宜。加菌量過(guò)多，如薄膜法，菌落擁擠，則不好計(jì)數(shù)；加菌量過(guò)少，則誤差較大。
9.5.4?進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，若因沒(méi)有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導(dǎo)致微生物回收的失敗，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)供試液進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)。此時(shí)更高稀釋級(jí)供試液的確認(rèn)要從低往高的稀釋級(jí)進(jìn)行，但最高稀釋級(jí)供試液選擇應(yīng)根據(jù)供試品應(yīng)符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，如供試品應(yīng)符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是1克細(xì)菌數(shù)不得過(guò)1000cfu，那么最高稀釋級(jí)是1:10?3。
若采用允許的最高稀釋級(jí)供試液進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求，那么應(yīng)選擇回收情況最接近要求的方法進(jìn)行供試品的檢測(cè)。如某種產(chǎn)品對(duì)某試驗(yàn)菌有較強(qiáng)的抑菌性能，采用薄膜過(guò)濾法的回收率為40％，而采用培養(yǎng)基稀釋法的回收率為30％，那么應(yīng)選擇薄膜過(guò)濾法進(jìn)行該供試品的檢測(cè)。在此情況下，生產(chǎn)單位或研制單位應(yīng)根據(jù)原輔料的微生物質(zhì)量、生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特性進(jìn)行產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以保證檢驗(yàn)方法的可靠性，從而保證產(chǎn)品質(zhì)量。
10?檢查法
10.1?平皿法
10.1.1?在上述進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，以該稀釋級(jí)吸管，吸取該稀釋級(jí)供試液各1ml至每個(gè)直徑90mm的滅菌平皿中，或從高稀釋級(jí)至低稀釋級(jí)吸液時(shí)可用1支吸管吸供試液各1ml至每個(gè)滅菌平皿中。每一稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少注2～3個(gè)平皿（一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開(kāi)，右手執(zhí)吸管），注皿時(shí)，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無(wú)殘留液體，防止反流到吸管尖端部。
10.1.2?陰性對(duì)照?待各級(jí)稀釋液注皿完畢后，用1支1ml吸管吸取試驗(yàn)用稀釋劑（pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液）各1ml，分別注入4個(gè)平皿中。其中2個(gè)作細(xì)菌數(shù)陰性對(duì)照；另2個(gè)作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對(duì)照，如另用YPD瓊脂測(cè)定酵母菌數(shù)時(shí)，則再增加2個(gè)平皿作酵母菌數(shù)陰性對(duì)照。
10.1.3?傾注培養(yǎng)基
將預(yù)先配制好的細(xì)菌計(jì)數(shù)用的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)用的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（霉菌）和YPD瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）熔化，冷至約45℃時(shí)，傾注上述各個(gè)平皿約15ml，以順時(shí)針或反時(shí)針?lè)较蚩焖傩D(zhuǎn)平皿，使供試液或稀釋液與培養(yǎng)基混勻，蓋上陶瓦蓋，或半蓋蓋，除去冷凝水后，再移去陶瓦蓋后，蓋上平皿蓋置操作平臺(tái)上待凝。在旋轉(zhuǎn)平皿時(shí)切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上。
10.1.4?培養(yǎng)
細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平板倒置于23～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，必要時(shí)延長(zhǎng)至7天。逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。
10.1.5?菌落計(jì)數(shù)
10.1.5.1?一般將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。勿漏計(jì)細(xì)小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長(zhǎng)的菌落。注意細(xì)菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之間，以及菌落與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡、油滴等的區(qū)別。必要時(shí)用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察，或挑取可疑物涂片鏡檢。
10.1.5.2?供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點(diǎn)計(jì)在細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法需按該制劑微生物品種而定，并須觀察菌落特征及染色形態(tài)。
10.1.5.3?供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后有時(shí)形成數(shù)量很多的有形物，且難與菌落相區(qū)別。為了有利于菌落計(jì)數(shù)，可在操作時(shí)將適宜稀釋級(jí)的供試液多增加注皿（1～2個(gè)平皿）。注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中。在計(jì)數(shù)菌落時(shí)作為對(duì)照。或用含TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后該培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落為紅色，襯于白色背景上易于點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌落和區(qū)分其他有形物。有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長(zhǎng)的菌落不易辨認(rèn)和點(diǎn)計(jì)，為防止這種情況，也可用含TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿。TTC的用量應(yīng)以不抑制微生物生長(zhǎng)為宜，通常使用的濃度為0.001％。
10.1.5.4?若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重疊，肉眼可辨別時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)；若平板生長(zhǎng)有鏈狀或片狀、云霧狀菌落，菌落間無(wú)明顯界線，一條鏈、片作為一個(gè)菌落計(jì)，但若鏈、片上出現(xiàn)性狀與鏈、片狀菌落不同的可辨菌落時(shí)，仍應(yīng)分別計(jì)數(shù)，若生長(zhǎng)蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落，其外緣有若干性狀相似的單個(gè)菌落，一般不宜作為計(jì)數(shù)用。
10.1.5.5?菌落生長(zhǎng)呈蔓延趨勢(shì)者，細(xì)菌需在24h，霉菌需在48h做初步點(diǎn)計(jì)（點(diǎn)計(jì)霉菌菌落時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)平板，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)，否則使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差）。
10.1.5.6?在培養(yǎng)3天點(diǎn)計(jì)細(xì)菌，培養(yǎng)5天點(diǎn)計(jì)霉菌時(shí)，如菌落極小，不易辨認(rèn)，細(xì)菌計(jì)數(shù)可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至5天；霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天，再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。
10.1.5.7?對(duì)有異議的供試品以YPD培養(yǎng)基作酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，可培養(yǎng)至1周再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。
10.1.5.8?含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)計(jì)霉菌數(shù)，YPD瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)計(jì)酵母菌數(shù)。兩者合并計(jì)數(shù)。
10.1.5.9?在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)多的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。
10.1.6?菌數(shù)報(bào)告規(guī)則
10.1.6.1?宜選取細(xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)小于300cfu、霉菌菌落數(shù)平均數(shù)小于100cfu的平板計(jì)數(shù)作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。
10.1.6.2?當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)有2個(gè)或2個(gè)以上稀釋劑的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)值的值報(bào)告。
10.1.6.3?如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均茵落數(shù)小于1時(shí)，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)。
菌數(shù)報(bào)告規(guī)則示例見(jiàn)下表2。
表2?菌數(shù)報(bào)告規(guī)則示例
| 菌數(shù)報(bào)告
規(guī)則示例 |
各稀釋級(jí)（供試液1mlㄍ皿）平均菌落計(jì)數(shù)（cfu） | 菌數(shù)報(bào)告數(shù)
（cfuㄍg，ml，10cm2） |
|||
| 原液 | 1:10（－1） | 1:102（－2） | 1:103（－3） | ||
| 1 | —— | 64 | 8 | 2 | 640 |
| 2 | —— | 420 | 64 | 8 | 6400 |
| 3 | —— | 不可計(jì) | 420 | 64 | 64000 |
| 4 | —— | 0 | 0.5 | 0 | ＜100 |
| 5 | —— | —— | 0 | 0 | ＜100 |
| 6 | —— | 0 | 0 | 0 | ＜10 |
| 7 | 0 | 0 | 0 | —— | ＜1 |
10.2?薄膜過(guò)濾法
10.2.1?薄膜過(guò)濾法主要起到富集微生物、分離去除樣品中對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生干擾的因素的作用，可以有效提高檢查結(jié)果的靈敏度和可靠性，是近年來(lái)微生物檢查領(lǐng)域中日益廣泛應(yīng)用的一種技術(shù)手段。
10.2.2?薄膜過(guò)濾法采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45um。濾膜直徑一般為50mm，為便于計(jì)數(shù)，以及減輕供試液堵塞濾膜的情況，在便于操作的前提下，可以選用直徑更大的濾膜或薄膜過(guò)濾器。采用不同直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。
10.2.3?水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，以濾膜直徑為50mm的濾膜計(jì)，每張濾膜每次沖洗量不超過(guò)100ml，總沖洗量不得超過(guò)1000ml；其他直徑的濾膜及薄膜過(guò)濾器可按膜面積比例調(diào)整，總的原則是避免大體積、過(guò)高流速的沖洗造成濾膜上的微生物受損傷。
10.2.4?由于供試液中一些不能通過(guò)濾膜的顆粒存在，常常造成濾膜堵塞、壓力升高，嚴(yán)重情況時(shí)可能發(fā)生過(guò)濾裝置炸裂造成安全事故或?qū)嶒?yàn)室污染；也可能發(fā)生由于壓力過(guò)大濾膜開(kāi)裂或?yàn)V膜孔徑變大，造成濾膜對(duì)微生物的過(guò)濾截留失敗。所以，實(shí)際操作中應(yīng)考慮對(duì)薄膜過(guò)濾中的壓力控制和設(shè)備的安全性，設(shè)置一定的安全壓力限度，例如濾膜兩側(cè)壓差不得過(guò)50psi。具體壓力限度應(yīng)根據(jù)具體薄膜過(guò)濾裝置及濾膜確定。
10.2.5?采用適當(dāng)方法去除供試液中的顆粒（前提是不能影響微生物的回收率）、適當(dāng)增加薄膜面積或降低過(guò)濾液體流速可以有效降低濾膜兩側(cè)的壓力差。
10.2.6?取相當(dāng)于每張濾膜含1g、1ml或10cm2供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過(guò)濾。若供試品每1g、1ml或10cm2所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液1ml，過(guò)濾。用pH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量見(jiàn)10.2.3及10.2.4。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板上時(shí)不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長(zhǎng)。
10.2.7?貼膏劑宜采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)。
10.2.8?陰性對(duì)照試驗(yàn)?取試驗(yàn)用的稀釋液1ml照上述薄膜過(guò)濾法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。
10.2.9?培養(yǎng)和計(jì)數(shù)?培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過(guò)100cfu。
10.2.10?菌數(shù)報(bào)告規(guī)則?以相當(dāng)于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以＜1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過(guò)濾1g、1ml或10cm2供試品），或＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。
10.3?培養(yǎng)基稀釋法
取低稀釋級(jí)供試液（原液或1:10供試液或其他供試液）2份，每份各1ml，分別注入平皿中（每皿0.5ml、0.2ml或＜0.2m1），每1個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。
每份供試液所加注平板點(diǎn)計(jì)的菌落之和，即為每lml菌落數(shù)，共得2組數(shù)據(jù)。以2份低稀釋級(jí)供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。
10.4?結(jié)果報(bào)告
10.4.1?菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)據(jù)報(bào)告。
10.4.2?菌落數(shù)大于100時(shí)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。
10.5?復(fù)試
供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)其中任一項(xiàng)一次檢驗(yàn)不合格，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)重新取2倍包裝量的供試品，依法作單項(xiàng)復(fù)試兩次，以三次檢驗(yàn)結(jié)果的均值報(bào)告。若3次結(jié)果的平均值超過(guò)該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定；否則，判供試品符合規(guī)定。
10.6?注意事項(xiàng)
10.6.1?菌落計(jì)數(shù)測(cè)定每計(jì)數(shù)單位（每皿或每膜）的最適計(jì)數(shù)范圍不宜過(guò)低，通常每計(jì)數(shù)單位不應(yīng)少于25cfu，低于這一限度越多誤差越大，故應(yīng)根據(jù)實(shí)際微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和污染程度確定適宜的供試液稀釋級(jí)數(shù)和計(jì)數(shù)測(cè)定方法。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)限度過(guò)低或因?yàn)椴僮餍枰┰嚻废♂尦潭冗^(guò)高，可以取較大體積供試液通過(guò)薄膜過(guò)濾法富集計(jì)數(shù)測(cè)定。不同限度標(biāo)準(zhǔn)宜采用的供試液稀釋級(jí)及對(duì)應(yīng)宜采用的計(jì)數(shù)測(cè)定方法見(jiàn)下表3。
表3?不同限度標(biāo)準(zhǔn)宜采用的供試液稀釋級(jí)及對(duì)應(yīng)宜采用的計(jì)數(shù)測(cè)定方法
| 限度標(biāo)準(zhǔn)
cfuㄍg，ml，10cm2 |
一般2～3個(gè)供試液稀釋級(jí)對(duì)應(yīng)宜選用的計(jì)數(shù)測(cè)定方法 | ||||
| 原液 | 1:10（－1） | 1:102（－2） | 1:103（－3） | 1:104（－4） | |
| ＜10 | ■ | ■ | |||
| 10 | ●■ | ■ | |||
| 100 | ●▲■ | ●■ | ■ | ||
| 1000 | ●▲■ | ●■ | ■ | ■ | |
| 10000 | ●▲ | ●▲■ | ●■ | ●■ | |
| 100000 | ●▲ | ●▲ | |||
●：平皿法（供試液體積：1mlㄍ皿）；
▲：平皿法（培養(yǎng)基稀釋法供試液體積：＜1mlㄍ皿）；
■：薄膜過(guò)濾法（供試液體積可以比較靈活）。
10.6.2?供試品檢驗(yàn)全過(guò)程必須符合無(wú)菌技術(shù)要求。使用滅菌用具時(shí)，不能接觸可能污染的任何器物，滅菌吸管不得用口吹吸。
10.6.3?供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過(guò)1h。否則，可能導(dǎo)致微生物繁殖或死亡而影響計(jì)數(shù)結(jié)果。
10.6.4?供試液稀釋及注皿時(shí)應(yīng)取均勻的供試液，以免造成實(shí)驗(yàn)誤差。
10.6.5?為避免細(xì)菌菌落蔓延生長(zhǎng)，宜采取下列方法處理：
10.6.5.1?開(kāi)蓋干燥?將已凝固的瓊脂平板開(kāi)蓋，倒置斜放于凈化工作臺(tái)上，開(kāi)機(jī)1～2h后合蓋，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
10.6.5.2?換陶瓦蓋?將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。
10.6.5.3?加TTC?于傾注培養(yǎng)基前，在每1000ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1％TTC溶液1ml（最終濃度為0.001％），混勻后傾注平皿。
11?檢驗(yàn)報(bào)告書(shū)寫(xiě)
本品按《中國(guó)藥典》2010年版微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，結(jié)果符合或不符合規(guī)定。
表4?細(xì)菌、霉菌、酵母菌形態(tài)特征比較（營(yíng)養(yǎng)瓊脂及玫瑰紅鈉瓊脂平板）
| 菌落形態(tài) | 細(xì)菌 | 霉菌 | 酵母菌 | |
| 菌
落 |
大小 | 差別很大，在同一平板上可出現(xiàn)針尖大小至大于10mm菌落 | 一般較大，亦有細(xì)小的菌落。在同一平板上生長(zhǎng)的菌落大小有時(shí)不一致 | 多數(shù)直徑為1～2mm，在同一平板上生長(zhǎng)的菌落大小有時(shí)不一致 |
| 外觀形態(tài) | 多樣，小而突起或大而扁平 | 多為圓形，有的蔓延生長(zhǎng)為無(wú)定形 | 培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)者多為圓形，內(nèi)層生長(zhǎng)者為圓形、鐵餅、紡錘或三角形 | |
| 色澤 | 白、灰白或無(wú)色，亦有淡褐、淡黃及淡紅色，菌落正反面顏色相同 | 小菌落灰白，大菌落形成孢子后顏色多樣。菌落正反面顏色不同 | 乳白或粉紅色多見(jiàn)，在同一平板上色調(diào)較單一 | |
| 透明度 | 透明或不透明 | 小菌落半透明有明顯折光性，大菌落不透明 | 透明較差 | |
| 邊緣 | 整齊或不整齊。有放射線狀、樹(shù)枝狀、鋸齒狀、卷發(fā)狀。低倍鏡下一般見(jiàn)不到邊緣 | 菌絲體構(gòu)成，多呈放射狀 | 整齊、低倍下可見(jiàn)球狀．卵圓狀或假菌絲狀．細(xì)胞細(xì)密排列 | |
| 氣味 | 一般有臭味 | 往往有霉味 | 多帶酒香味 | |
| 與培養(yǎng)基結(jié)合 | 不結(jié)合 | 結(jié)合較牢固，不易挑起 | 不結(jié)合，易挑起 | |
| 生長(zhǎng)速度 | 一般很快 | 較慢 | 較快 | |
| 細(xì)
胞 |
形態(tài) | 球或桿狀，細(xì)小均一。高倍鏡或油鏡下可觀察形態(tài) | 菌絲體相互交織．成熟霉菌常有產(chǎn)孢組織及孢子 | 多數(shù)為圓或卵圓形，常有芽體相連 |
| 排列 | 單個(gè)、分散或有一定的排列方式 | 絲狀交織 | 單個(gè)分散 | |
二、控制菌檢查
l?簡(jiǎn)述
控制菌檢查是用于檢查某些特定微生物（控制菌或其他致病菌），規(guī)定按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。
由于控制菌檢查為一次性報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故應(yīng)注意方法的有效性確證（方法驗(yàn)證或陽(yáng)性對(duì)照）、實(shí)驗(yàn)過(guò)程保障和結(jié)果確證，以提高檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。既要避免漏檢造成的假陰性結(jié)果。也要避免實(shí)驗(yàn)室污染造成的假陽(yáng)性結(jié)果。
控制菌檢查中，涉及實(shí)驗(yàn)室監(jiān)控菌株的分離鑒定、樣品陽(yáng)性菌株的分離分析、方法驗(yàn)證試驗(yàn)中的陽(yáng)性菌操作等，應(yīng)在專門(mén)的陽(yáng)性菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。除另有規(guī)定外，陽(yáng)性菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合國(guó)家Ⅱ級(jí)生物安全標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性菌實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備生物安全柜。陽(yáng)性菌操作不得在供試品檢驗(yàn)用潔凈實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。
2?方法驗(yàn)證
在建立供試品的控制菌檢查法或原檢查法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性時(shí)，應(yīng)對(duì)供試品的抑菌活性及檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)．按各供試品微生物限度項(xiàng)下的規(guī)定（給藥途徑）選擇相應(yīng)的菌株，并按供試液的制備和控制菌檢查法所規(guī)定的方法進(jìn)行。
2.1?儀器、設(shè)備及用具
見(jiàn)各控制菌檢查項(xiàng)下。
2.2?試液、指示液
見(jiàn)各控制菌檢查項(xiàng)下。
2.3?培養(yǎng)基
見(jiàn)各控制菌檢查項(xiàng)下。
2.4?方法驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)菌株
應(yīng)根據(jù)具體品種項(xiàng)下的目標(biāo)控制菌選擇相應(yīng)的驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)菌株，常用目標(biāo)控制菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株如下：
大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102]
金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC(B) 26003]
乙型副傷寒沙門(mén)菌Salmonella paratyphi B[CMCC(B) 50094]
銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa[CMCC(B) 10104]
生孢梭菌Clostridium sporogenes[CMCC(B)64941]
白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001]
菌液制備取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌培養(yǎng)物少許，接種至l0ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，取均勻培養(yǎng)物1ml，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成每1ml含菌10～100cfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對(duì)照試驗(yàn)的同時(shí)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定。生孢梭菌接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液制成1ml含10～100cfu的菌液。
2.5?供試液的制備（見(jiàn)細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)）
2.6?驗(yàn)證方法
2.6.1?試驗(yàn)組取規(guī)定量供試液和10～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制菌的檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，沖洗后，取出濾膜接至增菌培養(yǎng)基中。
2.6.2?陽(yáng)性對(duì)照?取10～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，按相應(yīng)控制菌的檢查法進(jìn)行檢查。
2.6.3?陰性對(duì)照取相應(yīng)的稀釋液替代供試液，按相應(yīng)控制菌的檢查法進(jìn)行檢查。
2.7?結(jié)果判定
陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，陰性對(duì)照組應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)建立新的方法，消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。
驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。
（一）大腸埃希菌
1?簡(jiǎn)述
大腸埃希菌（Escherichia coli）即大腸桿菌，為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧埃希菌等5個(gè)種。大腸埃希菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌。表明該樣品受到人和溫血?jiǎng)游锏募S便污染，即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外尚有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保汪人體健康，口服藥品必須檢查大腸埃希菌。
用4-甲基傘形酮葡糖苷酸（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG）和靛基質(zhì)（indole）試驗(yàn)檢查大腸埃希菌是一項(xiàng)新技術(shù)，其檢驗(yàn)步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌中分離單個(gè)菌，如MUG、Indole試驗(yàn)為陽(yáng)性或陰性即可報(bào)告結(jié)果。
原理：利用目標(biāo)菌限定酶作用的底物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng)作為指示系統(tǒng)來(lái)鑒定目標(biāo)菌。
實(shí)驗(yàn)證明96％的大腸埃希菌含β-葡糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUD)，約10％的沙門(mén)菌屬一些菌種也含有此酶。MUG被GUD水解，產(chǎn)生熒光，由于熒光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強(qiáng)千萬(wàn)倍，易于觀察，沒(méi)有主觀性，因而用MUG鑒定大腸埃希菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測(cè)。單一的MUG鑒別大腸埃希菌其漏檢率達(dá)6％，鑒于98％的大腸埃希菌基靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽(yáng)性，故將MUG與靛基質(zhì)試驗(yàn)結(jié)合，比單用MUG可提高大腸埃希菌的檢出率。如MUG與Indole試驗(yàn)的反應(yīng)不一致時(shí)，則需將供試液的增菌培養(yǎng)物用EMB瓊脂平板分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗(yàn)鑒別。該法理論上可使大腸埃希菌的檢出率達(dá)98％。
如僅用IMViC生化試驗(yàn)來(lái)鑒別大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌，專屬性不強(qiáng)。
2?儀器、設(shè)備及用具（參照細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)）
3?試液指示液
3.1?0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液（附件二3.1）
3.2?無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）（附件二3.3)
3.3?無(wú)菌對(duì)氨基苯甲酸溶液（附件二2.2）
3.4?無(wú)菌聚山梨酯80氯化鈉溶液（附件二3.2）
3.5?靛基質(zhì)試液（附件二2.17）
3.6?甲基紅試液（附件二4.2）
3.7?V-P試液（附件二2.11，2.13）
3.8?革蘭染色液（附件二2.4，2.10，2.16）
3.9?中性紅指示液（附件二4.1）
3.10?亞甲藍(lán)指示液（附件二4.3）
3.11?溴麝香草酚藍(lán)指示液（附件二4.6）
3.12?酸性品紅指示液（附件二4.7）
3.13?曙紅鈉指示液（附件二4.9）
4?培養(yǎng)基
4.1?營(yíng)養(yǎng)肉湯（附件二5.1）
4.2?營(yíng)養(yǎng)瓊脂（附件二5.2）
4.3?膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基（附件二5.6）
4.4?4－甲基傘形酮葡糖苷酸蛋白胨培養(yǎng)基（附件二5.7）
4.5?乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、5％乳糖培養(yǎng)基（附件二5.21，5.22）
4.6?蛋白胨水培養(yǎng)基（附件二5.18）
4.7?磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基（附件二5.19）
4.8?枸櫞酸鹽培養(yǎng)基（附件二5.20）
4.9?曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂（附件二5.8）
4.10?麥康凱瓊脂（附件二5.9）
5?準(zhǔn)備
5.1?對(duì)照用菌液（見(jiàn)方法驗(yàn)證）
5.2?供試品的檢驗(yàn)量（見(jiàn)細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)5.3）
5.3?供試液的制備（見(jiàn)細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)）
6?操作步驟
6.1?檢驗(yàn)程序
陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)?供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10～100cfu，供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的控制菌檢查。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。
陰性對(duì)照試驗(yàn)?取稀釋劑10m1加入100ml（或200 m1）相應(yīng)控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
6.2?增菌培養(yǎng)?取膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基3瓶，每瓶各100ml。2瓶分別加入規(guī)定量的供試液（相當(dāng)于供試品1g、lml、10cm2），其中1瓶加入對(duì)照菌10～100個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照，第3瓶加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。培養(yǎng)18～24h，必要時(shí)可延至48h。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24h在366nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。在紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)藍(lán)白色熒光，為MUG陽(yáng)性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照的MUG和靛基質(zhì)試驗(yàn)應(yīng)為陰性。如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。
6.3?分離培養(yǎng)如呈現(xiàn)MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)將上述供試品BL增菌培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上。培養(yǎng)18～24h。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與表1所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。
表1?大腸埃希菌菌落形態(tài)特征
| 培養(yǎng)基 | 菌落形態(tài) |
| 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 | 呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無(wú)明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，常有金屬光澤 |
| 麥康凱瓊脂 | 鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn) |
當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照的平板呈典型菌落生長(zhǎng)時(shí)，若EMB或麥康凱瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落與表1所列菌落形態(tài)特征相符或疑似者，應(yīng)挑取可疑菌落進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和IMViC試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。
為了規(guī)范操作，以下是對(duì)藥典要求的補(bǔ)充。
6.4?純培養(yǎng)?如EMB或麥康凱瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落與表1所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2～3個(gè)以上疑似菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18～24h，作以下檢查。
如平板上無(wú)單個(gè)可疑菌落，但有可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18～24h，再挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。
6.5?革蘭染色、鏡檢
6.5.1?以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫，再通過(guò)火焰2～3次干燥使固定。
6.5.2?滴加結(jié)晶紫染液，染色1min，水洗。
6.5.3?滴加碘液，媒染1min，水洗，以濾紙吸干余水。
6.5.4?滴加95%乙醇，脫色20～30s，至流出液無(wú)色，水洗。
6.5.5?滴加沙黃染液，復(fù)染1min，待干后，鏡檢。
6.5.6?染色結(jié)果
革蘭陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色；革蘭陰性菌呈紅色。
大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。
6.5.7?注意事項(xiàng)
6.5.7.1?玻片必須潔凈，無(wú)劃痕。涂片的菌量宜少，菌液不可過(guò)濃。否則，菌細(xì)胞成堆或連成片。染色反應(yīng)難于判斷，不利菌細(xì)胞的形態(tài)觀察。
如菌液過(guò)濃，須再取潔凈載玻片進(jìn)一步稀釋。
6.5.7.2?培養(yǎng)物的菌齡以16～24h為宜。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的革蘭陽(yáng)性菌易染成紅色。
6.5.7.3?脫色是關(guān)鍵。脫色時(shí)間不足，菌細(xì)胞易染成陽(yáng)性；脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌細(xì)胞易染成陰性。
7?生化試驗(yàn)
7.1?乳糖發(fā)酵試驗(yàn)?取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24～48h，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色；指示劑為溴麝香草酚藍(lán)者為黃色），產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無(wú)論大小都是產(chǎn)氣）。
為避免遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種5％乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于24h出現(xiàn)陽(yáng)性。或適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。
7.2?靛基質(zhì)試驗(yàn)（Ⅰ）?取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48h，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。98％的大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽(yáng)性。一般24h即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，以無(wú)菌操作先從管中取出1或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)是陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24h，作靛基質(zhì)試驗(yàn)。
7.3?甲基紅試驗(yàn)（M）?取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液2～3滴（約每ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動(dòng)，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。
7.4?乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P）?取上述斜面培養(yǎng)物。接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于2ml培養(yǎng)液中加入α-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40％氫氧化鉀試液0.4ml，充分振搖，在4h（通常在30min）內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽(yáng)性，無(wú)紅色反應(yīng)為陰性。
7.5?枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）?取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)2～4天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色無(wú)改變、無(wú)菌生長(zhǎng)為陰性。
8?結(jié)果判斷
8.1?當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)MUG呈陽(yáng)性，供試品MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌。MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。
8.2?MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性、IMViC試驗(yàn)為－＋??、革蘭陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性、IMViC試驗(yàn)為＋＋??、革蘭陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌。
8.3?供試品培養(yǎng)物檢查不符合8.2二項(xiàng)中的任一項(xiàng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。
8.4?當(dāng)陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)或陽(yáng)性對(duì)照未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)菌落不是大腸埃希菌，不能做出檢驗(yàn)報(bào)告。
9?注意事項(xiàng)
9.1?MUG法不必從混合菌中分離單個(gè)菌落。除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、沙門(mén)菌屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽(yáng)性球菌、桿菌和芽孢菌，其MUG為陽(yáng)性。因此，在MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉的量，可排除革蘭陽(yáng)性菌的干擾。在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中志賀菌、沙門(mén)菌較難生長(zhǎng)。
9.2?配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正pH值，滅菌后pH不得過(guò)7.4，否則pH值偏高，MUG分解，本身則顯熒光；分裝MUG培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管、蛋白胨不得顯熒光。
9.3?培養(yǎng)時(shí)間?供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中，一般培養(yǎng)5h和24h要觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準(zhǔn)確判斷時(shí)，可延長(zhǎng)培養(yǎng)至48h再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌各菌株間的GUD的活性不完全相同，對(duì)底物和底物的濃度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時(shí)問(wèn)、溫度；pH值的改變；大量競(jìng)爭(zhēng)菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對(duì)結(jié)果的判斷亦有影響。
9.4?結(jié)果觀察?取供試品的MUG試驗(yàn)管、陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管同時(shí)在366nm紫外光燈下觀察，陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)有較強(qiáng)的藍(lán)白色熒光，陰性對(duì)照管無(wú)熒光。供試品MUG管是否有熒光，應(yīng)仔細(xì)觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中），適當(dāng)傾斜試管。如陽(yáng)性對(duì)照管熒光強(qiáng)烈，影響供試品管與陰性對(duì)照管的觀察時(shí)，亦可移去陽(yáng)性對(duì)照管。
9.5?藥品中污染的大腸埃希菌，易受生產(chǎn)工藝及藥物的影響。在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂平板上的菌落形態(tài)特征時(shí)有變化，挑取可疑菌落往往憑經(jīng)驗(yàn)，主觀性較大，務(wù)必挑選2～3個(gè)以上菌落分別做IMViC試驗(yàn)鑒別，挑選菌落越多，檢出陽(yáng)性菌的機(jī)率越高，如僅挑選一個(gè)菌落做IMViC試驗(yàn)鑒別．則易漏檢。
9.6?在IMViC試驗(yàn)中，以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。切勿將培養(yǎng)基帶入枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。
根據(jù)試驗(yàn)資料，發(fā)現(xiàn)某些菌培養(yǎng)3天后，構(gòu)櫞酸鹽利用試驗(yàn)產(chǎn)生陽(yáng)性，故僅培養(yǎng)2天是不夠的，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間可延長(zhǎng)至4天。
9.7?以IMViC試驗(yàn)來(lái)判斷大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌是含混的。IMViC試驗(yàn)為＋＋??者，除大腸埃希菌外，還有非活躍大腸埃希菌（E.coli jnactive）、弗格森埃希菌（E.fergusonii）、赫爾曼埃希菌（E.hermanii）。IMViC試驗(yàn)為－＋??者，除大腸埃希菌外，還有非活躍大腸埃希菌（E.coli inactive）、傷口埃希菌（E.vulneris）、蟑螂埃希菌（E.blattae）。
9.8?陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)是檢查供試品是否有抑菌作用及培養(yǎng)條件是否適宜。陽(yáng)性對(duì)照菌液的制備、計(jì)數(shù)及加入含供試品的培養(yǎng)基中等操作，不能在檢測(cè)供試品的潔凈實(shí)驗(yàn)室或凈化臺(tái)上進(jìn)行，必須在單獨(dú)的隔離間或凈化臺(tái)操作，以免污染供試品及操作環(huán)境。
9.9?在各類供試品中檢測(cè)大腸埃希菌及其他控制菌，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)驗(yàn)。檢出的大腸埃希菌及其他控制菌培養(yǎng)物須保留1個(gè)月，備查。
（二）大腸菌群
1?簡(jiǎn)述
大腸菌群（Coliform）是指37℃生長(zhǎng)時(shí)能發(fā)酵乳糖，在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌。符合上述定義的細(xì)菌除大腸埃希菌屬（Escherichia）的多數(shù)菌外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬（Enterobacter）、枸櫞酸菌屬（Citrobacter）、克雷伯菌屬（Klebsiella）的多數(shù)菌。大腸菌群包括了正常人畜腸道內(nèi)需氧的的大多數(shù)革蘭陰性桿菌。以大腸菌群作為衛(wèi)生指示菌比控制大腸埃希菌具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義，檢查方法簡(jiǎn)便。因此，國(guó)際上以大腸菌群作為藥品、食品、飲水等的衛(wèi)生指示菌，對(duì)衛(wèi)生質(zhì)量的要求更嚴(yán)格。
大腸菌群的檢查通過(guò)增菌、分離、革蘭染色、鏡檢和確證試驗(yàn)等步驟。
2?儀器、設(shè)備及用具（見(jiàn)大腸埃希菌檢查法）
3?試液、指示液（見(jiàn)大腸埃希茵檢查法）
4?培養(yǎng)基
4.1?乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基（附件二5.21）
4.2?乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（附件二5.22）
4.3?曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂（附錄5.8）
4.4?麥康凱瓊脂（附錄5.9）
5?對(duì)照用菌液（大腸埃希菌，同控制菌方法驗(yàn)證2.4）
6?操作步驟
6.1?操作程序
6.2?增菌培養(yǎng)?取乳糖膽鹽發(fā)酵管3支，分別加入1:10稀釋的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1m1)、1:100稀釋的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）和1:1000稀釋的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）。另取1支乳糖膽鹽發(fā)酵管，加入稀釋劑1ml作為陰性對(duì)照。均培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。
加供試液的乳糖膽鹽發(fā)酵管若無(wú)菌生長(zhǎng)、或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則判該管未檢出大腸菌群。若乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)進(jìn)一步分離培養(yǎng)。
6.3?分離培養(yǎng)?將上述產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中的培養(yǎng)物，分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24h。
大腸菌群的菌落在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板上呈紫黑色或紫紅色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上呈鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落特征不符或?yàn)榉歉锾m陰性無(wú)芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(zhǎng)有疑似菌落，且為革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。
6.4?確證試驗(yàn)?從上述分離平板上挑選4～5個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24～48小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。
6.5?結(jié)果判斷?根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按表2報(bào)告1g或1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。
表2?大腸菌群MPN（Most probable number）表
| 各供試品量的檢出結(jié)果 | 最可能的大腸菌群數(shù)N
（個(gè)ㄍg或ml） |
||
| 1.0g或1.0ml | 0.1g或0.1ml | 0.01g或0.01ml | |
| ＋ | ＋ | ＋ | ＞102 |
| ＋ | ＋ | － | 10＜N＜102 |
| ＋ | － | － | 1＜N＜10 |
| － | － | － | ＜1 |
注：＋?檢出大腸菌群。－?未檢出大腸菌
7?注意事項(xiàng)
7.1?加供試液的乳糖膽鹽發(fā)酵管，由于有的藥渣顏色較深或沉淀物較多，干擾結(jié)果的觀察。應(yīng)仔細(xì)觀察倒管底部或試管壁、培養(yǎng)液表面有無(wú)氣泡。針尖大的氣泡也是產(chǎn)氣。
7.2?乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)的倒管不小于30mm×3mm（內(nèi)徑）。否則，倒管被藥渣遮擋，不便觀察結(jié)果。
7.3?加供試液的乳糖膽鹽發(fā)酵管，經(jīng)培養(yǎng)后，其倒管內(nèi)無(wú)論產(chǎn)氣多少，均應(yīng)做分離培養(yǎng)，革蘭染色、鏡檢。如產(chǎn)氣太少，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。
7.5?盡可能多挑選曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上大腸菌群的可疑菌落，做乳糖發(fā)酵確證試驗(yàn)。挑可疑菌落越多，可提高大腸菌群檢出率。
（三）沙門(mén)菌
1?簡(jiǎn)述
沙門(mén)菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，按《Bergey系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第一卷（1984），沙門(mén)菌分5個(gè)亞屬，2003年出版的第八版的《臨床微生物手冊(cè)》將沙門(mén)菌屬分成兩個(gè)菌種及腸炎沙門(mén)菌和乍得沙門(mén)菌，其中的腸炎沙門(mén)菌分6個(gè)亞屬，包括常見(jiàn)的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷寒、鼠傷寒，豬霍亂等沙門(mén)菌在內(nèi)，當(dāng)時(shí)已發(fā)現(xiàn)2501個(gè)血清型。O抗原抗血清的A-E群包含了沙門(mén)菌分離株的95％，所以用沙門(mén)菌A-FO多價(jià)血清進(jìn)行沙門(mén)菌初篩試驗(yàn)。藥品中的沙門(mén)菌，是以鑒定沙門(mén)菌屬為準(zhǔn)，即對(duì)每10g（或10m1）藥品中是否檢出沙門(mén)菌作出檢驗(yàn)報(bào)告。
由于沙門(mén)菌血清型繁多，各血清型的生化及血清學(xué)特性雖密切相關(guān)，卻不盡相同，采用一種增菌培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能涵蓋所有沙門(mén)菌的最適增菌及分離條件。此外，由于藥品在生產(chǎn)過(guò)程中，常受到加熱、干燥等加工步驟的影響，藥品中污染的沙門(mén)菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進(jìn)行預(yù)增菌，然后再進(jìn)行增菌及分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等步驟。
2?儀器、設(shè)備及用具（見(jiàn)大腸埃希菌檢查法2）
3?試液指示液（參見(jiàn)大腸埃希菌檢查法3）
3.1?無(wú)菌脲試液（附件二2.5）
3.2?酚磺酞指示液（附件二4.4）
3.3?亮綠試液（附件二2.9）
3.4?氰化鉀試液（附件二2.14）
3.5?溴甲酚紫指示液（附件二4.5）
3.6?革蘭染色液（附件二2.4，2.10，2.16）
3.7?沙門(mén)菌屬A～F“0”多價(jià)血清（0多價(jià)1）。
4?培養(yǎng)基
4.1?營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.2）
4.2?營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（附件二5.1）
4.3?半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.3）
4.4?曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）（附件二5.8）
4.5?麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）（附件二5.9）
4.6?四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）（附件二5.11）
4.7?三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（TSI）（附件二5.10）
4.8?膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL）（附件二5.13）
4.9?沙門(mén)菌扁志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（S.S）（附件二5.12）
4.10?蛋白胨水培養(yǎng)基（附件二5.18）
4.11?脲（尿素）瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.23）
4.12?氰化鉀培養(yǎng)基（附件二5.24）
4.13?賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基（附件二5.25）
5?對(duì)照用菌液
取乙型副傷寒沙門(mén)菌[CMCC(B) 50094]的培養(yǎng)物少許，接種至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)。30～35℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋濃度相當(dāng)于10～100cfuㄍml，作陽(yáng)性對(duì)照用菌液。其菌液濃度可用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得。
6?操作方法
6.1?準(zhǔn)備工作：[見(jiàn)細(xì)菌、霉菌（酵母菌）計(jì)數(shù)6 ]
6.2?增菌培養(yǎng)
6.2.1?預(yù)增菌取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3份，每份200ml，1份加入10g或者10ml供試品，混勻；1份加入供試品及陽(yáng)性對(duì)照菌10～100cfu，混勻；1份加入稀釋劑10ml作陰性對(duì)照，30～35℃培養(yǎng)18～24h后觀察。搖動(dòng)陰性對(duì)照瓶后應(yīng)清亮透明，無(wú)菌生長(zhǎng)。
6.2.2?增菌培養(yǎng)?輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽(yáng)性對(duì)照瓶，分別吸取1ml接種于1管含10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)18～24h。
6.3?分離培養(yǎng)輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽(yáng)性對(duì)照瓶，分別以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液接種于膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門(mén)菌志賀菌瓊脂（SS）平板及曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個(gè)，倒置培養(yǎng)24～48h，必要時(shí)延長(zhǎng)至40～48h。檢查平板上有無(wú)疑似沙門(mén)菌菌落。沙門(mén)菌在上述平板上的菌落形態(tài)特征見(jiàn)下表。
表3?沙門(mén)菌的菌落特征
| 平板 | 菌落形態(tài) |
| 膽鹽硫乳瓊脂（DHL） | 無(wú)色至淺橙色．半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無(wú)黑色 |
| 沙門(mén)菌屬志賀菌屬瓊脂（S.S） | 無(wú)色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色 |
| 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB） | 無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落 |
| 麥康凱瓊脂（MacC） | 無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色 |
由于沙門(mén)菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，一般為無(wú)色半透明，多數(shù)沙門(mén)菌因產(chǎn)生H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平板上較為明顯。在SS瓊脂平板上，H2S特征有時(shí)不明顯，沙門(mén)菌屬亞屬I(mǎi)II因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生H2S，在有H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心。在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門(mén)菌屬細(xì)菌，也可呈現(xiàn)類似沙門(mén)菌菌落形態(tài)，須進(jìn)一步鑒別。由于藥物的影響或非典型菌株的存在，沙門(mén)菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意辨別。
6.4?初步鑒別試驗(yàn)
從每個(gè)供試品的分離平板上挑取2～3個(gè)疑似菌落（菌落形態(tài)特征與表3所列的形態(tài)特征相符或疑似）分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種時(shí)應(yīng)以接種針輕輕接觸單個(gè)菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面（或者克氏雙糖鐵瓊脂斜面）并穿刺到底層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。
疑似沙門(mén)菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應(yīng)為：①斜面紅色（產(chǎn)堿），底層黑色（產(chǎn)H2S）并顯示黃色（產(chǎn)酸）；②斜面紅色，底層黃色；③斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門(mén)菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)生氣體的菌種。對(duì)在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時(shí)底層無(wú)黑色，斜面未見(jiàn)紅色底層未見(jiàn)黃色，或斜面及底層均為紅色者可以排除沙門(mén)菌。
將疑似沙門(mén)菌的三糖鐵瓊脂或營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作生化試驗(yàn)，血清凝集試驗(yàn)及革蘭染色，鏡檢。沙門(mén)菌應(yīng)為革蘭陰性桿菌。
6.5?生化試驗(yàn)
6.5.1?靛基質(zhì)試驗(yàn)?用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，照大腸桿菌檢查法靛基質(zhì)試驗(yàn)項(xiàng)下操作、判斷結(jié)果。沙門(mén)菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。
6.5.2?脲酶試驗(yàn)?用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，劃線接種于脲瓊脂斜面，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。斜面變?yōu)榧t色為陽(yáng)性反應(yīng)，沙門(mén)菌屬為陰性反應(yīng)。
6.5.3?氰化鉀試驗(yàn)?將培養(yǎng)物先接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～24h，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)液1環(huán)，接種至氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，另取一環(huán)培養(yǎng)液接種于不含氰化鉀的同樣培養(yǎng)基內(nèi)作對(duì)照管，接種后即以橡膠塞塞緊，培養(yǎng)24～48h，觀察結(jié)果。對(duì)照管內(nèi)有菌生長(zhǎng)（混濁），而試驗(yàn)管也有菌生長(zhǎng)為陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)照管有菌生長(zhǎng)（混濁）而試驗(yàn)管無(wú)菌生長(zhǎng)（清亮）為陰性反應(yīng)。沙門(mén)菌應(yīng)為陰性反應(yīng)。
本試驗(yàn)應(yīng)十分注意密封管口，夏天分裝培養(yǎng)基宜在冰浴中進(jìn)行，防止氰化鉀分解，產(chǎn)生氫氰酸逸出，致使培養(yǎng)基內(nèi)氰化鉀濃度降低，不能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，造成假陽(yáng)性。
氰化鉀為劇毒品、操作時(shí)須謹(jǐn)慎，切勿用口吸液。用后的培養(yǎng)基每管加數(shù)粒硫酸亞鐵和20％氫氧化鉀0.5ml去毒。然后再滅菌、洗滌。
6.5.4?賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種在賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基中，同時(shí)接種一支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對(duì)照管，培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。對(duì)照管黃色（產(chǎn)酸），試驗(yàn)管呈紫色為陽(yáng)性反應(yīng)（賴氨酸脫羧產(chǎn)堿）；試驗(yàn)管黃色為陰性反應(yīng)。沙門(mén)菌應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)。
6.5.5?動(dòng)力試驗(yàn)用接種針沾取培養(yǎng)物，穿刺接種于半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂管中，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。有動(dòng)力的細(xì)菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散生長(zhǎng)使培養(yǎng)基呈混濁現(xiàn)象；無(wú)動(dòng)力的細(xì)菌僅能沿穿刺線生長(zhǎng)，不向外擴(kuò)散，培養(yǎng)基仍呈清晰透明狀；無(wú)動(dòng)力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保留2～3天后，再行觀察。沙門(mén)菌除雞雛沙門(mén)菌及無(wú)動(dòng)力的變種外，均具有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，動(dòng)力試驗(yàn)陽(yáng)性。沙門(mén)菌生化反應(yīng)的初步鑒別見(jiàn)下表。
表4?沙門(mén)菌與有關(guān)細(xì)菌在三糖鐵瓊脂及初步生化試驗(yàn)的鑒別
| 序號(hào) | 靛基質(zhì) | 脲酶 | 氰化鉀 | 賴氨酸脫羧酶 | 判定菌屬 | ||||
| 斜面 | 底層 | 產(chǎn)氣 | 硫化氫 | ||||||
| 1.1 | － | ＋ | ＋／－ | ＋／－ | － | － | － | ＋ | 沙門(mén)菌屬 |
| 1.2 | ＋／－ | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | － | ＋ | 沙門(mén)菌屬I(mǎi)II |
| 2 | － | ＋ | ＋／－ | ＋ | ＋ | － | － | ＋ | 緩慢愛(ài)德華菌屬 |
| 3 | ＋／－ | － | ＋／－ | ＋／－ | －／＋ | －／＋ | ＋／－ | － | 弗勞地檸檬酸桿菌 |
| 4.1 | － | ＋ | ＋S | ＋ | － | ＋ | ＋ | － | 奇異變形桿菌 |
| 4.2 | － | ＋ | ＋／－S | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | － | 普通變形桿菌 |
| 5 | ＋／－ | ＋ | ＋／－ | － | ＋／－ | － | － | ＋／－ | 大腸埃希菌 |
| 6 | － | ＋ | － | － | －／＋ | － | － | － | 志賀菌屬 |
| 7.1 | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | ＋／－ | ＋ | － | 陰溝腸桿菌 |
| 7.2 | ＋ | ＋ | ＋ | － | － | ＋／－ | ＋ | ＋ | 肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌 |
| 8 | － | ＋ | ＋S／－ | － | ＋ | ＋／－ | ＋ | － | 普羅菲登斯菌屬、摩根菌屬 |
| 9 | － | ＋ | ＋／－ | － | － | －／＋ | ＋ | ＋ | 蜂房哈夫尼亞菌、黏質(zhì)沙雷菌 |
針對(duì)三糖鐵瓊脂上的反應(yīng)，＋產(chǎn)酸（黃色），陽(yáng)性，陽(yáng)性率，＞90％；－產(chǎn)堿（紅色），陰性，陰性率，＞90％；＋／－多數(shù)陽(yáng)性、少數(shù)陰性；＋S產(chǎn)生少量氣體；生化試驗(yàn)的結(jié)果參見(jiàn)本章6.5內(nèi)容；＋陽(yáng)性，陽(yáng)性率，＞90％；－陰性，陰性率，＞90％；＋／－多數(shù)陽(yáng)性、少數(shù)陰性，－／＋多數(shù)陰性、少數(shù)陽(yáng)性（本表依據(jù)何曉青衛(wèi)生防疫細(xì)菌檢驗(yàn)，參考第八版《美國(guó)臨床微生物手冊(cè)》，反應(yīng)序號(hào)1除典型反應(yīng)外，脲酶、氰化鉀試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)三項(xiàng)中有一項(xiàng)異常；反應(yīng)序號(hào)2僅靛基質(zhì)陽(yáng)性；可結(jié)合血清學(xué)凝集試驗(yàn)，或加做部分生化試驗(yàn)，判定是否為沙門(mén)菌，其他情況可排除沙門(mén)菌。
6.6?血清學(xué)凝集試驗(yàn)
6.6.1?準(zhǔn)備1片潔凈的滅菌載玻片，在近中央的一端，以直徑3mm接種環(huán)沾取沙門(mén)菌屬0多價(jià)1血清2～3環(huán)制成與玻片橫徑相垂直的條形涂抹，長(zhǎng)約1.5cm，寬約0.5cm。另一端用生理鹽水代替血清同法操作，作為陰性對(duì)照。
6.6.2?用接種環(huán)分別挑取三糖鐵瓊脂斜面或營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物少許，在血清和鹽水中混勻。菌量要適當(dāng)，勿過(guò)濃。
6.6.3?將玻片前后傾斜數(shù)次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進(jìn)行觀察，陰性對(duì)照不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，試驗(yàn)組任何程度的凝集現(xiàn)象都是陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性反應(yīng)通常在3min內(nèi)發(fā)生。有時(shí)因血清效價(jià)低、反應(yīng)遲緩時(shí)，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，并放一個(gè)濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20min，再觀察結(jié)果。如果仍然沒(méi)有出現(xiàn)凝集，應(yīng)取斜面培養(yǎng)物，置含少量生理鹽水的試管中，制成濃菌懸液，在100℃水浴中保溫30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷，再做凝集試驗(yàn)，如出現(xiàn)凝集，仍判為陽(yáng)性反應(yīng)；如不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則為陰性反應(yīng)。
6.6.4?如對(duì)照試驗(yàn)出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為非特異反應(yīng)，須對(duì)該菌株培養(yǎng)物進(jìn)行處理后再作凝集試驗(yàn)。
7?結(jié)果判斷
7.1?供試品培養(yǎng)物為革蘭陰性桿菌，三糖鐵瓊脂反應(yīng)及生化反應(yīng)符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)，沙門(mén)菌屬0多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)l00℃30min處理后凝集試驗(yàn)為陽(yáng)性反應(yīng)），報(bào)告10g或10ml供試品檢出沙門(mén)菌。
7.2?供試品培養(yǎng)物三糖鐵瓊脂反應(yīng)或生化反應(yīng)不符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)及沙門(mén)菌屬0多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)為陰性反應(yīng)（含待檢培養(yǎng)物經(jīng)100℃30min處理后凝集試驗(yàn)為陰性反應(yīng)），報(bào)告1g或1ml供試品未檢出沙門(mén)菌。
7.3?供試品培養(yǎng)物出現(xiàn)下列情況應(yīng)繼續(xù)鑒定或保留菌種送交有關(guān)單位進(jìn)一步鑒定后，再作報(bào)告。
7.3.1?供試品培養(yǎng)物生化反應(yīng)符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)，沙門(mén)菌屬0多價(jià)1血清凝集試驗(yàn)陰性反應(yīng)。
7.3.2?供試品培養(yǎng)物生化反應(yīng)不符合沙門(mén)菌屬反應(yīng)，沙門(mén)菌屬0多價(jià)1血清凝集反應(yīng)呈陽(yáng)性反應(yīng)。
7.4?對(duì)已檢出沙門(mén)菌的供試品分離菌種，有條件者，應(yīng)進(jìn)一步作菌型鑒定。根據(jù)檢出菌的特性，推斷可能菌型，增加生化試驗(yàn)項(xiàng)目及沙門(mén)菌單因子血清“O”及“H”凝集試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。
8?注意事項(xiàng)
8.1?試驗(yàn)用培養(yǎng)基，需經(jīng)過(guò)質(zhì)量鑒定，用已知典型反應(yīng)菌株（如乙型副傷寒沙門(mén)菌[CMCC(B) 50094]進(jìn)行測(cè)試，其靈敏度及特征性反應(yīng)應(yīng)符合要求。培養(yǎng)基需在規(guī)定條件保存，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用。分離平板在使用前應(yīng)置30～35℃溫箱內(nèi)倒置孵育1～2h，使其表面溫暖濕潤(rùn)，利于分離沙門(mén)菌。
8.2?在對(duì)供試品進(jìn)行測(cè)試的同時(shí)，需做陽(yáng)性菌對(duì)照及陰性對(duì)照。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)顯示陽(yáng)性結(jié)果，否則檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。在進(jìn)行陽(yáng)性菌對(duì)照試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)與供試品檢驗(yàn)分開(kāi)操作，避免污染。特別是用接種環(huán)沾取菌液進(jìn)行接種或分離時(shí)，避免動(dòng)作過(guò)大，形成氣溶膠，污染供試品檢驗(yàn)用具及操作環(huán)境。
8.3?為保證試驗(yàn)方法的可靠性，對(duì)分離平板上的疑似菌落，應(yīng)多選取幾個(gè)菌落同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。挑取菌落時(shí)，不要在分離平板菌落密集部位挑取可疑菌落，而應(yīng)在菌落分布稀疏部位挑選。
8.4?生化試驗(yàn)及血清學(xué)試驗(yàn)的被鑒定培養(yǎng)物必須是純培養(yǎng)物，否則，不可能得到正確結(jié)果。如遇血清學(xué)凝集試驗(yàn)陽(yáng)性而生化試驗(yàn)不符合時(shí)，應(yīng)首先檢查培養(yǎng)物的純度。對(duì)已污染的培養(yǎng)物，不應(yīng)丟棄，因?yàn)槲廴揪赡苎谏w沙門(mén)菌，故應(yīng)對(duì)被污染的培養(yǎng)物重新分離，仔細(xì)選取單個(gè)菌落再進(jìn)行試驗(yàn)。
8.5?所有生化反應(yīng)均需按照規(guī)定的試驗(yàn)要求進(jìn)行，如觀察三糖鐵瓊脂斜面反應(yīng)的時(shí)間，應(yīng)在24士2h，時(shí)間過(guò)短過(guò)長(zhǎng)，都可能出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果判斷。又如氰化鉀試驗(yàn)，試管口應(yīng)密塞，否則氰化鉀濃度降低，致使抑菌作用下降，產(chǎn)生錯(cuò)誤的判定結(jié)果。
8.6?血清凝集試驗(yàn)的影響因素甚多，除與電解質(zhì)、pH、溫度有關(guān)外，須特別注意抗原與抗體用量的比例恰當(dāng)，只有當(dāng)二者濃度適當(dāng)時(shí)，凝集反應(yīng)方明顯可見(jiàn)。由于本法試驗(yàn)用多價(jià)血清，其凝集力相對(duì)較弱，試驗(yàn)用菌液量切不能過(guò)大。測(cè)試前，應(yīng)用已知陽(yáng)性菌測(cè)試以掌握適宜菌液濃度。
8.7?沙門(mén)菌為腸道重要致病菌，操作時(shí)應(yīng)特別注意防止分離待檢菌及陽(yáng)性對(duì)照菌對(duì)操作環(huán)境及試驗(yàn)的污染。所有用過(guò)的增菌、分離、生化試驗(yàn)培養(yǎng)基、血清學(xué)凝集試驗(yàn)及染色鏡檢后的玻片等，均需經(jīng)滅菌后方能洗滌。
（四）銅綠假單胞菌
1?簡(jiǎn)述
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），習(xí)稱綠膿桿菌，為假單胞菌屬菌種，廣泛分布在土壤，水及空氣，人和動(dòng)物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在，故可通過(guò)環(huán)境和生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)污染藥品。本菌是常見(jiàn)的化膿性感染菌、在燒傷、燙傷，眼科及其他外科疾患中常引起繼發(fā)感染，由于本菌對(duì)許多抗菌藥物具有天然的耐藥性，增加了治療的難度、國(guó)內(nèi)外藥典均將銅綠假單胞菌檢查列為檢查項(xiàng)目之一。銅綠假單胞菌按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢及生化試驗(yàn)等步驟進(jìn)行檢驗(yàn)。
2?儀器、設(shè)備和用具（見(jiàn)大腸埃希茵檢驗(yàn)法2）
3?試液、指示液
3.1?0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液（附件二3.1，3.3）
3.2?1%二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液（附件二2.1）
3.3?鹽酸試液（附件二2.12）
3.4?三氯甲烷（附件二1.57）
4?培養(yǎng)基
4.1?營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（附件二5.1）
4.2?膽鹽乳糖（BL）培養(yǎng)基（附件二5.6）
4.3?營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.2）
4.4?溴代十六烷基三甲胺（附件二5.14）
4.5?綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基（PDP瓊脂）（附件二5.26）
4.6?明膠培養(yǎng)基（附件二5.27）
4.7?硝酸鹽胨水培養(yǎng)基（附件二5.28）
5?對(duì)照用菌液
銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，于30～35℃培養(yǎng)18～24h后，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋濃度相當(dāng)于10～100個(gè)cfu／ml，作陽(yáng)性對(duì)照用菌液。其菌液濃度可在做陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的同時(shí)用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得。
6?操作方法
6.1?供試品的取樣量[見(jiàn)細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)6]
6.2?供試液的制備[見(jiàn)細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)7]
6.3?增菌培養(yǎng)
取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml，1份加入1:10供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g或1ml）；1份加入供試液及陽(yáng)性對(duì)照菌；l份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。于30～35℃培養(yǎng)18～24h（必要時(shí)可延至48h）。陰性對(duì)照菌應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
6.4?分離培養(yǎng)
輕輕搖動(dòng)上述增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)取1～2環(huán)培養(yǎng)液（如有菌膜應(yīng)挑取之），劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板，于30～35℃培養(yǎng)18～24h。銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基平板上的典型菌落為扁平、圓形或無(wú)定形、邊緣不齊，光滑濕潤(rùn)，呈灰白色，周邊略呈擴(kuò)散現(xiàn)象，在菌落相鄰處常有融合現(xiàn)象。菌落周?chē)Ｓ兴苄运{(lán)綠色素?cái)U(kuò)散，使培養(yǎng)基顯藍(lán)綠色，但亦有不產(chǎn)色素的菌株。菌落還有粗糙型和黏液型等，應(yīng)注意挑選。
6.5?純培養(yǎng)
供試品分離平板生長(zhǎng)6.4所述典型菌落或呈疑似菌落時(shí)，以接種針輕輕接觸單個(gè)菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑取2～3個(gè)疑似菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)，作以下檢查。
6.6?革蘭染色鏡檢
6.6.1?革蘭染色（見(jiàn)大腸埃希菌檢查6.5）
6.6.2?鏡檢
銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無(wú)芽孢桿菌，單個(gè)，成對(duì)或成短鏈排列。
6.7?生化試驗(yàn)
可用銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]做生化試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照株。
6.7.1?氧化酶試驗(yàn)
取一小塊白色潔凈的濾紙置平皿內(nèi)，以無(wú)菌玻璃棒挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，涂在濾紙上，隨即滴加1滴新配制的1％二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺試液，在30s內(nèi)，紙片上的培養(yǎng)物出現(xiàn)粉紅色，逐漸變?yōu)樽霞t色，即為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)。若培養(yǎng)物不變色或僅顯粉色為陰性反應(yīng)。
本試驗(yàn)應(yīng)注意：
（1）試驗(yàn)菌落（苔）必須新鮮，陳舊培養(yǎng)物反應(yīng)結(jié)果不可靠。
（2）試驗(yàn)避免與鐵、鎳等金屬接觸，不可用普通接種針（環(huán)）（白金材料除外）挑取菌（苔），否則易出現(xiàn)假陽(yáng)性。宜用玻璃棒或木棒。
（3）試劑宜新鮮配制，放置過(guò)久，二鹽酸二甲基對(duì)苯二胺氧化變色不可用。
（4）反應(yīng)需在有氧條件下進(jìn)行，勿滴加試劑過(guò)多，以免浸泡培養(yǎng)物使之與空氣隔絕，造成假陰性反應(yīng)。
（5）麥康凱、SS培養(yǎng)基等含糖培養(yǎng)基上的菌落不適于做氧化酶試驗(yàn)，因?yàn)樘欠纸猱a(chǎn)酸抑制氧化酶活性。
6.7.2?綠膿菌素試驗(yàn)
取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基（PDP）斜面上，30～35℃培養(yǎng)24h后，觀察斜面有無(wú)色素，如有色素，在試管內(nèi)加三氯甲烷3～5ml，以無(wú)菌玻棒攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。使培養(yǎng)物中的色素完全萃取在三氯甲烷內(nèi)。靜置片刻，待三氯甲烷分層，用吸管將三氯甲烷移至另一試管中，加入鹽酸試液（1mol／L）約1ml，振搖后靜置片刻，如在鹽酸液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色、即為陽(yáng)性反應(yīng)，無(wú)粉紅色出現(xiàn)為陰性反應(yīng)。本試驗(yàn)可用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面作陰性對(duì)照，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)呈陰性。如培養(yǎng)基斜面無(wú)色素產(chǎn)生，應(yīng)于室溫培養(yǎng)l～2天再按上法試驗(yàn)。凡經(jīng)再次檢驗(yàn)，綠膿菌素試驗(yàn)仍為陰性者應(yīng)繼續(xù)以下試驗(yàn)。
6.7.3?硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)
以接種環(huán)沾取少許營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。如果在培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體產(chǎn)生，即為陽(yáng)性反應(yīng)，表明該培養(yǎng)物能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)?。小倒管?nèi)無(wú)氣泡者為陰性反應(yīng)。
6.7.4?42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)
以接種環(huán)沾取少許營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物于0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液中，制成菌懸液。然后將菌懸液劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，立即置41℃士1℃的恒溫水浴箱內(nèi)，務(wù)使整個(gè)斜面浸沒(méi)在水浴中，培養(yǎng)24～48h，斜面如有菌苔生長(zhǎng)者為陽(yáng)性反應(yīng)；無(wú)菌苔生長(zhǎng)為陰性反應(yīng)。
6.7.5?明膠液化試驗(yàn)
以接種針沾取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，穿刺深度應(yīng)接近培養(yǎng)基的底部，于30～35℃培養(yǎng)24h。取出放入0～4℃冰箱內(nèi)10～30min。如培養(yǎng)基呈溶液狀，即為明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)；如明膠呈凝固狀，為陰性反應(yīng)。
本試驗(yàn)應(yīng)注意：
（1）本試驗(yàn)接種前，培養(yǎng)基應(yīng)為固態(tài)，否則需將培養(yǎng)基置冰箱內(nèi)使之凝固后，再穿刺接種。
（2）試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)未接種細(xì)菌的陰性對(duì)照管，與試驗(yàn)管同時(shí)培養(yǎng)并觀察結(jié)果。
7?結(jié)果報(bào)告
7.1?供試品培養(yǎng)物經(jīng)證實(shí)為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗(yàn)及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽(yáng)性者，即報(bào)告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。
7.2?供試品培養(yǎng)物氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，鏡檢為革蘭陰性桿菌的培養(yǎng)物，綠膿菌素試驗(yàn)陰性時(shí)，其硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、42℃生長(zhǎng)試驗(yàn)及明膠液化試驗(yàn)皆為陽(yáng)性時(shí)，亦報(bào)告1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌。
7.3?凡與7.1與7.2結(jié)果不符時(shí)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出銅綠假單胞茵。
8?注意事項(xiàng)
8.1?銅綠假單胞菌污染藥品后，因生產(chǎn)工藝和藥物的影響，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)可產(chǎn)生非典型形態(tài)。為防止漏檢，在挑取疑似菌落時(shí)，宜取2～3個(gè)以上菌落，分別進(jìn)行檢驗(yàn)，以提高銅綠假單胞菌的檢出率。
8.2?綠膿菌素是銅綠假單胞菌鑒定的重要特征，但色素的產(chǎn)生受許多因素的影響，除菌株差異及變異外，培養(yǎng)條件是重要因素，溫度、培養(yǎng)基成分等皆可影響色素產(chǎn)生。培養(yǎng)基中瓊脂、蛋白胨等均應(yīng)事先測(cè)試，選用適宜品牌，試驗(yàn)時(shí)并用陽(yáng)性菌株作對(duì)照試驗(yàn)。
（五）金黃色葡萄球菌
1?簡(jiǎn)述
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為葡萄球菌屬中的一種，廣泛分布于自然界?？諝?、土壤、水及物品上，人和動(dòng)物皮膚及與外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在。本菌可產(chǎn)生多種毒素及酶，這些毒性物質(zhì)能引起局部及全身化膿性炎癥，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展成為敗血癥和膿毒血癥，是人類化膿性感染中重要的病原菌。本菌抵抗力較強(qiáng)，干燥情況下能生存數(shù)月，80℃30min的條件下尚能存活，5％石碳酸或0.1％升汞溶液10～15min才會(huì)被殺死。
金黃色葡萄球菌檢查按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢和血漿凝固酶試驗(yàn)等步驟進(jìn)行。本法適用于外用藥品及一般滴眼劑、眼膏劑的檢查。
2?儀器、設(shè)備及用具（見(jiàn)大腸埃希菌檢查法2）
3?試液、指示液
3.1?0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液或無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）（附件二3.1，3.3）
3.2?革蘭染色液（附件二2.4，2.10，2.16）
3.3?無(wú)菌枸櫞酸鈉氯化鈉溶液（附件二2.7）
3.4?血漿的制備
以無(wú)菌注射器吸取滅菌的含5％枸櫞酸鈉的0.9％的氯化鈉溶液1ml，用無(wú)菌操作采取家兔（或羊、人）血9ml，輕輕混勻數(shù)分鐘。待血液不凝固時(shí)，徐徐放入滅菌離心管中，離心（500 r／min離心5min），分離血漿，用滅菌吸管將血漿轉(zhuǎn)移至滅菌試管中，置冰箱備用。臨用前必須用已知血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌（如金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]）測(cè)試，證明血漿合格后，方可用于實(shí)驗(yàn)。
3.5?1％酚磺酞指示液（附件二4.4）
4?培養(yǎng)基
4.1?營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（附件二5.1）
4.2?營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.2）
4.3?亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基（附件二5.15）
4.4?卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.16）
4.5?甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.17）
5?對(duì)照用菌液
取金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，接種至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液按10倍遞增稀釋濃度相當(dāng)于10～100cfu／ml，作陽(yáng)性對(duì)照用菌液。其菌液濃度可在做陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的同時(shí)用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)得。（見(jiàn)方法驗(yàn)證用標(biāo)準(zhǔn)菌株2.4）
6?操作方法
6.1?供試品的檢驗(yàn)量[見(jiàn)細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)6]
6.2?供試液的制備[見(jiàn)細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)7]
6.3?增菌培養(yǎng)
取營(yíng)養(yǎng)肉湯（或亞碲酸鈉肉湯）培養(yǎng)基3份，每份100ml，1份加入10ml供試液，1份加入供試液及陽(yáng)性對(duì)照菌，1份加入與供試液等量的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液（pH7.2）作為陰性對(duì)照，置30～35℃培養(yǎng)18～24h（必要時(shí)可延至48h）。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
6.4?分離培養(yǎng)將上述供試品增菌培養(yǎng)液，以接種環(huán)沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，置30～35℃培養(yǎng)24～72h。當(dāng)供試品分離平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，或有菌落生長(zhǎng)但不同于下表所列特征，可報(bào)告為1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。
表5?金黃色葡萄球菌在三種選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征
| 培養(yǎng)基 | 菌落形態(tài)特征 |
| 卵黃氯化納瓊脂 | 金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)，外周有分解卵磷脂后產(chǎn)生的乳濁圈，菌落直徑1～2mm |
| 甘露醇氯化納瓊脂 | 金黃色，圓形凸起，邊緣整齊．光滑濕潤(rùn)．外周有黃色環(huán)。菌落直徑0.7～1mm |
6.5?純培養(yǎng)
當(dāng)供試品分離平板生長(zhǎng)菌落與表1所列菌落特征相似或疑似時(shí)，應(yīng)選取2～3個(gè)以上菌落，分別用接種針，輕輕沾取菌落中心表面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，于30～35℃培養(yǎng)18～24h，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭染色、鏡檢及接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂肉湯于30～35℃培養(yǎng)18～24h做血漿凝固酶試驗(yàn)。
6.6?革蘭染色、鏡檢
6.6.1?革蘭染色（見(jiàn)大腸埃希菌檢查法6.5）
6.6.2?鏡檢金黃色葡萄球菌為革蘭陽(yáng)性球菌，無(wú)芽孢，一般不產(chǎn)生莢膜。排列呈不規(guī)則的葡萄狀，亦可呈單個(gè)、成雙或短鏈狀排列。
6.7?血漿凝固酶試驗(yàn)
試管法：取無(wú)菌試管（10mm×100mm）3支，各加入血漿和0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液（1:1）0.5ml，1支加入瓊脂斜面培養(yǎng)物菌懸液（或被檢菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液）0.5ml，其余2支作對(duì)照管：1支加入金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]培養(yǎng)物菌懸液或營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5ml作為陽(yáng)性對(duì)照；另一支加入營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對(duì)照。三管同時(shí)置37℃水浴或恒溫培養(yǎng)箱，3h后開(kāi)始檢查，以后每隔適當(dāng)時(shí)間觀察一次，直至24h。檢查時(shí)，輕輕將試管傾斜（動(dòng)作勿大），仔細(xì)觀察，陰性對(duì)照管血漿流動(dòng)自如，陽(yáng)性對(duì)照管血漿呈凝固狀，試驗(yàn)管呈凝固者為陽(yáng)性反應(yīng)；不凝固為陰性反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管任何一管不符合要求時(shí)，應(yīng)另制備血漿，重新試驗(yàn)。
7?結(jié)果判斷
如果革蘭染色結(jié)果清晰可靠（必要時(shí)加做已知革蘭染色結(jié)果的細(xì)菌進(jìn)行染色質(zhì)量控制），凝固酶試驗(yàn)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果，供試品培養(yǎng)物按下列情況報(bào)告或處理：
7.1?疑似菌革蘭染色呈陽(yáng)性球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)者，報(bào)告1g或1ml供試品檢出金黃色葡萄球菌（少許菌株可能不是金黃色葡萄球菌而是葡萄球菌屬的其他菌種）。
7.2?革蘭染色鏡檢不是革蘭陽(yáng)性球菌，或血漿凝固酶試驗(yàn)陰性反應(yīng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌。
7.3?陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。
7.4?陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性結(jié)果，應(yīng)當(dāng)加做驗(yàn)證試驗(yàn)，考察檢品是否有抑菌活性。
8?注意事項(xiàng)
8.1?金黃色葡萄球菌在上述兩種分離培養(yǎng)基上的典型菌落為金黃色。但由于受藥物影響或非典型菌株存在，亦可呈橙黃色、檸檬色或白色。做控制菌檢查，對(duì)非典型菌落也有必要進(jìn)行凝固酶試驗(yàn)做金黃色葡萄球菌的篩查，以防漏檢金黃色葡萄球菌。培養(yǎng)基存放時(shí)間和培養(yǎng)時(shí)間影響色素產(chǎn)生，故培養(yǎng)基應(yīng)新鮮配制。培養(yǎng)時(shí)間宜48h以上。
8.2?如果使用干燥培養(yǎng)基，應(yīng)按說(shuō)明書(shū)配制，注意pH值是否符合規(guī)定，必要時(shí)應(yīng)校正pH后滅菌使用。
8.3?血漿凝固酶試驗(yàn)應(yīng)用新鮮培養(yǎng)物及新鮮血漿。如用陳舊培養(yǎng)物及血漿（纖維蛋白常已析出）易導(dǎo)致假陰性反應(yīng)。此外，觀察結(jié)果時(shí)不要搖動(dòng)試管，因凝固初期凝塊易破壞，引起假陰性試驗(yàn)。
8.4?葡萄球菌屬在新版《Bergey手冊(cè)》中共收載為28種，在微生物菌種鑒定中目前應(yīng)用較多的2003年出版的第八版《美國(guó)臨床微生物手冊(cè)》共收錄35個(gè)菌種，44個(gè)菌型。常見(jiàn)有金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌3種?？蓞⒄障卤磉M(jìn)行鑒定。其中又以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的鑒別最為重要。
表6?3種葡萄球菌的主要性狀
| 性狀 | 金黃色葡萄球菌 | 表皮葡萄球菌 | 腐生葡萄球菌 |
| 菌落色素 | 主要為金黃色 | 主要為白色 | 主要為檸檬色 |
| 大小（菌落直徑） | 0.8～1.0mm | 0.5～1.5mm | 0.5～1.5mm |
| α溶血毒素 | ＋ | －／極少＋ | － |
| 甘露醇 | |||
| 需氧 | ＋ | d | d |
| 厭氧 | ＋ | － | － |
| 凝固酶 | ＋ | － | － |
| 卵黃反應(yīng) | ＋ | － | － |
| 耐熱DNA酶 | ＋ | － | － |
| 對(duì)新生霉素敏感性 | S | S | R |
| 噬菌體分型 | 多數(shù)能分型 | 不能分型 | 不能分型 |
| A蛋白 | ＋ | － | － |
| 致病性 | 強(qiáng) | 弱或無(wú) | 無(wú) |
d結(jié)果不確定，S敏感，R耐藥
8.5?目前商品化的金黃色葡萄球菌檢測(cè)試劑多家微生物相關(guān)制劑公司有售，試劑具有較好的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。商品化的檢測(cè)試劑應(yīng)當(dāng)在適當(dāng)?shù)臈l件下保存，在有效期內(nèi)應(yīng)用。
（六）梭菌
1?簡(jiǎn)述
梭菌屬（Clostridium）過(guò)去稱為梭狀芽孢桿菌屬，菌體1um×5um左右的革蘭陽(yáng)性桿菌，能形成芽孢。芽孢多大于菌體的寬度，細(xì)菌膨脹呈梭形，故名梭狀芽孢桿菌。該菌屬中主要病原菌有產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)、破傷風(fēng)梭菌（C.tetani）、肉毒梭菌（C.botulinum）和艱難梭菌（C.difficile），均能產(chǎn)生強(qiáng)烈的外毒素使人和動(dòng)物致病。因此，對(duì)于某些用于陰道、創(chuàng)傷、潰瘍的藥品，必須控制梭菌。
檢查梭菌的方法主要是增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)和鏡檢形態(tài)觀察，必要時(shí)做分離培養(yǎng)后再行鑒定。
2?儀器、設(shè)備及用具
2.1?玻璃器皿
試管（30mm×200mm）等。洗滌干凈，無(wú)殘留抗菌物質(zhì)，包扎后，滅菌備用[見(jiàn)細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)]。
2.2?天平、離心機(jī)、顯微鏡、高壓蒸汽滅菌器、恒溫干燥箱[見(jiàn)細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)]。
2.2.1?天平、高壓蒸汽滅菌器、恒溫干燥箱等應(yīng)定期進(jìn)行校驗(yàn)。
2.2.2?厭氧培養(yǎng)袋、箱（罐）等（有商品供應(yīng)），經(jīng)測(cè)試后選用。
2.3?潔凈實(shí)驗(yàn)室或凈化工作臺(tái)[見(jiàn)細(xì)菌、霉菌(酵母菌)計(jì)數(shù)2.1.1]。
2.4?手術(shù)鑷、手術(shù)剪及取樣匙，應(yīng)嚴(yán)密包扎，滅菌備用。
3?試液
3.1?革蘭染色液（附件二2.10，2.16，2.4）
3.2?厭氧指示劑（附件二4.8）
3.3?3％過(guò)氧化氫溶液
3.4?75％乙醇溶液
3.5?碘酊溶液或碘伏
3.6?0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液（附件二3.1）
3.7?苯扎溴銨（1:1000）溶液
4?培養(yǎng)基
4.1?硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（附件二5.33）
4.2?梭菌增菌培養(yǎng)基（附件二5.29）
4.3?哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基（含慶大霉素20mg／L和不含慶大霉素）（附件二5.30）
5?對(duì)照用菌液
生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B) 64941]。
菌液制備?取生孢梭菌接種至12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，置30～35℃培養(yǎng)18～24h，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成1ml含10～100cfu的菌液。生孢梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌液計(jì)數(shù)可取每毫升含100～1000cfu的菌液0.1ml涂布于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板置厭氧條件下培養(yǎng)48～72h計(jì)數(shù)；也可以取每毫升含10～100cfu的菌液1ml接種于不少于12ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，搖勻，置30～35℃培養(yǎng)18～20h計(jì)數(shù)其中的燈籠狀菌團(tuán)，一般情況下該燈籠狀菌團(tuán)數(shù)與平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)相當(dāng)。[見(jiàn)方法驗(yàn)證2.4]
生孢梭菌菌種的保存可取其硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)物混勻、凍存管分裝、超低溫保存（如－80℃），用時(shí)取出自然解凍、經(jīng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基復(fù)蘇、復(fù)壯，制備新鮮培養(yǎng)物使用。
6?操作方法
6.1?不同劑型樣品的前處理
6.1.1?散劑除去包裝，直接稱取規(guī)定量的樣品即可。
6.1.2?膠囊除去包裝，連殼一起稱取規(guī)定量樣品。
6.1.3?軟膏劑及栓劑稱取樣品10g，按細(xì)菌、霉菌、(酵母菌)計(jì)數(shù)6.23規(guī)定的適宜方法乳化，乳化后加入預(yù)熱至45℃的0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液，制成1:20供試液。
6.2?增菌培養(yǎng)
6.2.1?厭氧培養(yǎng)裝置的準(zhǔn)備除商品厭氧培養(yǎng)袋、箱、罐按使用說(shuō)明要求準(zhǔn)備外，實(shí)驗(yàn)室亦可用真空干燥器、標(biāo)本瓶或其他適宜容器替代使用，可選用下列一種方法制備厭氧條件：
6.2.1.1?冷觸媒法?臨用前，取試管或其他適宜容器3支，1支稱入硼氫化鈉0.22g（以厭氧培養(yǎng)容器容積1L計(jì)），1支稱取枸櫞酸0.33g、碳酸氫鈉0.37g，另1支放入經(jīng)活化的鈀粒約1g，與接種后的供試品培養(yǎng)管（或平板）及厭氧指示劑管1支，同時(shí)置于厭氧培養(yǎng)容器內(nèi)，隨即各加水5ml于前2支管（或容器）中，迅速密封容器蓋。鈀粒為覆蓋鈀的氧化鋁的球狀或條狀顆粒（有商品出售），用前需經(jīng)160℃干烤2h，或在電爐上灼燒5min使其活化。由于每用1次便失去催化性，因此，再次使用時(shí)需按上法活化后方能使用。將鈀粒若干置室溫水中，附有大量氣泡者為活性良好，可直接使用。此法可作為鈀粒的活性檢查。
6.2.1.2?焦性沒(méi)食子酸法用前，取培養(yǎng)皿或其他適宜容器1支，加入焦性沒(méi)食子酸10g及無(wú)水碳酸鈉5g（以厭氧容器容積1L計(jì)），與接種后的供試品培養(yǎng)管（或平板）及厭氧指示劑管1支同時(shí)置于厭氧容器內(nèi)，迅速密封容器蓋。
6.2.2?增菌培養(yǎng)?取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml）4份，其中2份置80℃保溫10min后迅速冷卻。上述4份供試液直接或處理后分別接種至100ml的梭菌增菌培養(yǎng)基中，其中2份（直接1份，處理后1份）梭菌增菌培養(yǎng)管中分別加入陽(yáng)性對(duì)照菌（10～100cfu）。置厭氧條件下培養(yǎng)48h。
6.3?分離培養(yǎng)取上述每一培養(yǎng)物0.2ml，分別涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng)48～72h。若供試品平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出梭菌；若供試品平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。
6.4?革蘭染色鏡檢取疑似菌落涂片，作革蘭染色、鏡檢，觀察染色及菌體特征。本菌形態(tài)特征較為典型。培養(yǎng)后形成的芽孢，初呈“火柴頭”狀卵圓形，繼而膨大呈球形，在菌體末端如鼓槌狀。培養(yǎng)時(shí)間至72h以上時(shí)，菌體可自溶而消失，僅見(jiàn)游離的芽孢囊，一般染色時(shí)呈圓圈狀。染色鏡檢有卵圓形至球形的芽孢，大于菌體，著生于菌體中央、次端或頂端，為梭菌典型形態(tài)。
6.5?過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)?加一滴3％過(guò)氧化氫溶液至瓊脂表面的單個(gè)分散的菌落，或轉(zhuǎn)移至載玻片上的菌落上。有氣泡形成表示過(guò)氧化氫酶反應(yīng)陽(yáng)性，梭菌應(yīng)成陰性結(jié)果?？捎每莶菅挎邨U菌作為陽(yáng)性反應(yīng)對(duì)照菌。
7?結(jié)果判斷
若上述可疑菌落為革蘭陽(yáng)性梭菌，有或無(wú)卵圓形或球形的芽孢。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。
8?注意事項(xiàng)
8.1?操作時(shí)勿損傷皮膚，若有損傷，應(yīng)立即注射破傷風(fēng)抗毒素，以防感染。
8.2?凡帶有活菌及毒素的器具，應(yīng)在徹底滅菌后方可洗滌。
（七）白色念珠菌
1?簡(jiǎn)述
白色念珠菌（Candida albicans）又名白假絲酵母菌（Saccharomyces albicaus）屬假絲酵母菌屬（Saccharomyces）。白色念珠茵是條件致病菌，是醫(yī)學(xué)全身性真菌感染病的重要組成之一，一旦感染，?？梢鹦膬?nèi)膜炎、肺炎、尿布疹、鵝口瘡、陰道炎、腦膜炎及敗血癥等。
白色念珠菌菌細(xì)胞呈圓形或卵圓形，直徑為3～6um，革蘭染色為陽(yáng)性，但菌體著色不均勻，以出芽方式繁殖，在適宜的培養(yǎng)基上有芽生孢子及假菌絲生長(zhǎng)，在假菌絲間其末端形成厚膜孢子。白色念珠菌具有β-硝基半乳糖苷酶，可分解NGL，使對(duì)一硝基苯酚游離，在堿性條件下顯色。
白色念珠菌廣泛分布于土壤、水和空氣中，目前國(guó)內(nèi)外的藥品、食品標(biāo)準(zhǔn)已把白色念珠菌作為微生物檢驗(yàn)中酵母菌的代表菌，因此有些藥品依據(jù)給藥途徑和劑型將白色念珠菌作為控制菌是非常必要的。
2?試驗(yàn)器材及條件
2.1?設(shè)備及器皿
生化培養(yǎng)箱（23～28℃）、恒溫培養(yǎng)箱（30～35℃）、水浴鍋、顯微鏡、三角燒瓶、吸管、培養(yǎng)皿等。
2.2?標(biāo)準(zhǔn)菌株
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]。
菌液制備?取新鮮白色念珠菌菌種接種至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，用0.9％無(wú)菌生理鹽水稀釋至含菌10～100cfu／ml。菌液可用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)測(cè)定。
2.3?培養(yǎng)基
沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（附件二5.35）
沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.36）
念珠菌顯色培養(yǎng)基（法國(guó)CHROMAGAR公司）[附件二5.37]
1％聚山梨酯80－玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（附件二5.38）
3?試驗(yàn)操作
取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2）直接或處理后接種至適量（不少于100m1）的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48 h。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，經(jīng)30～35℃，培養(yǎng)24～48h（必要時(shí)延長(zhǎng)至72h）。
白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈乳白色偶見(jiàn)淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。
若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。
如平板上生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，經(jīng)30～35℃培養(yǎng)24～48h（必要時(shí)延長(zhǎng)至72h）。若平板上無(wú)綠色或翠綠色的菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出白色念珠菌。
4?確認(rèn)試驗(yàn)
若平板上生長(zhǎng)的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1％聚山梨酯80－玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48h。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色，鏡檢及芽管試驗(yàn)。
芽管試驗(yàn)?挑取1％聚山梨酯80－玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤(rùn)的平皿內(nèi)，置35～37℃培養(yǎng)1～3h，置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)到由孢子長(zhǎng)出短小芽管。
若上述疑似菌為非革蘭陽(yáng)性菌，顯微鏡未見(jiàn)厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。
三、培養(yǎng)基適用性檢查
1?概述
培養(yǎng)基質(zhì)量是影響微生物檢驗(yàn)結(jié)果的重要環(huán)節(jié)。計(jì)數(shù)測(cè)定用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力是微生物限度檢查結(jié)果判斷的重要影響因素，控制菌檢查用培養(yǎng)基也可能由于其促生長(zhǎng)能力、指示能力、抑制能力的差異，從而對(duì)菌落顏色、形態(tài)等指標(biāo)存在較大差異，影響結(jié)果判斷的客觀性。
培養(yǎng)基適用性檢查是通過(guò)檢驗(yàn)用培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基的比較，以陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)狀態(tài)或特征來(lái)評(píng)價(jià)判斷檢驗(yàn)用培養(yǎng)基是否符合檢驗(yàn)要求。
微生物限度檢查用培養(yǎng)基主要分為細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)測(cè)定用培養(yǎng)基和控制菌檢查用培養(yǎng)基兩部分。2010版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法中收載了“適用性檢查”對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)量進(jìn)行控制。
2?培養(yǎng)基適用性檢查實(shí)驗(yàn)的一般要求
2.1?培養(yǎng)基適用性檢查適用范圍
2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定微生物限度檢查中成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。
培養(yǎng)基適用性檢查試驗(yàn)可用于確定實(shí)驗(yàn)室所使用培養(yǎng)基（包括購(gòu)置的不同批號(hào)的成品培養(yǎng)基、不同批號(hào)的脫水培養(yǎng)基干粉、按處方自行配制培養(yǎng)基所用不同批次的原材料等）、制備程序（包括水質(zhì)控制、配制方法、滅菌程序等）、保存條件（溫度、濕度、時(shí)間及盛裝培養(yǎng)基的容器條件等）等是否滿足微生物限度檢查用要求。即上述影響培養(yǎng)基質(zhì)量的各關(guān)鍵點(diǎn)應(yīng)通過(guò)培養(yǎng)基適用性檢查試驗(yàn)確定，如果其中有任一控制點(diǎn)發(fā)生變化應(yīng)重新進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。但是影響培養(yǎng)基質(zhì)量的關(guān)鍵控制點(diǎn)的變化應(yīng)掌握在微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的一般原則內(nèi)（見(jiàn)2.2），超過(guò)一般原則的培養(yǎng)基是否還能滿足微生物限度檢查用，無(wú)法通過(guò)培養(yǎng)基適用性檢查確定。
當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)異常，或?qū)嶒?yàn)室質(zhì)量控制需要，也可通過(guò)培養(yǎng)基適用性檢查提供一定依據(jù)。
總之，培養(yǎng)基適用性檢查是在正常條件下關(guān)于培養(yǎng)基質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)室控制措施，并不一定在每次具體的微生物限度檢查樣品檢測(cè)試驗(yàn)活動(dòng)中都必須同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查試驗(yàn)，但每次微生物檢查所用培養(yǎng)基均應(yīng)經(jīng)過(guò)適用性檢查。
2.2?微生物限度檢查用培養(yǎng)基質(zhì)量控制的一般原則
2.2.1?不同處方培養(yǎng)基的替代使用不能通過(guò)培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)簡(jiǎn)單確定。
2.2.2?培養(yǎng)基適用性檢查不能取代供應(yīng)商或其他法定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)培養(yǎng)基的有效期、保存條件、制備方法等的更嚴(yán)格的規(guī)定。
2.2.3?如果沒(méi)有特殊規(guī)定，培養(yǎng)基配制采用蒸餾水或純化水均可，但應(yīng)采用一定措施加以檢測(cè)控制，如蒸餾水應(yīng)核實(shí)pH是否為5～7；采用離子交換法制備的純化水，電阻值應(yīng)不小于2MΩ等。
2.2.4?盡量臨用現(xiàn)配。培養(yǎng)基滅菌后在能取出的前提下，盡快取出，切忌在高壓鍋內(nèi)過(guò)夜存留；固體培養(yǎng)基滅菌或融化后，融化狀態(tài)放置不得超過(guò)8h；一般預(yù)制培養(yǎng)基可置潔凈環(huán)境2～25℃保存，但不應(yīng)超過(guò)21天；固體瓊脂培養(yǎng)基熔化再使用應(yīng)不超過(guò)一次。
2.2.5?干粉培養(yǎng)基或培養(yǎng)基原料變質(zhì)不應(yīng)再用；預(yù)制培養(yǎng)基儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)現(xiàn)渾濁、變色、長(zhǎng)菌、嚴(yán)重脫水等變化不應(yīng)再用。
2.3?對(duì)照培養(yǎng)基
對(duì)照培養(yǎng)基應(yīng)通過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量研究和控制，具備性能穩(wěn)定、質(zhì)量?jī)?yōu)異的特點(diǎn)。對(duì)照培養(yǎng)基作為一種標(biāo)準(zhǔn)試劑，應(yīng)具備可靠的來(lái)源和質(zhì)量保障。
2.4?培養(yǎng)基適用性檢查指標(biāo)及常用方法
2.4.1?檢查指標(biāo)：促生長(zhǎng)能力、指示能力、抑制能力。
2.4.2?常用方法：直接接種法、澆碟法、表面接種法（涂布法）。
2.4.3?液體培養(yǎng)基通常采用直接接種法測(cè)定上述3種指標(biāo)，接種時(shí)應(yīng)注意接種量不得超過(guò)培養(yǎng)基體積的10％。固體培養(yǎng)基采用澆碟法和表面接種法測(cè)定上述指標(biāo)。采用澆碟法考察固體培養(yǎng)基時(shí)，為了保證取樣的平行性，平行測(cè)定兩皿求平均數(shù)；采用表面接種法（涂布法）考察固體培養(yǎng)基時(shí)，表面接種菌液不多于0.2ml／皿，盡量控制在0.1ml／皿，保證取樣間的平行性，平行測(cè)定兩皿觀察結(jié)果。
3?計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查
微生物限度檢查中計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基有3種，營(yíng)養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂和酵母浸出粉葡萄糖瓊脂。
3.1?計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查試驗(yàn)用菌株
大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]
白色念珠茵（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]
黑曲霉菌（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98003]
菌株的培養(yǎng)及菌液制備同微生物限度檢查方法驗(yàn)證。
3.2?實(shí)驗(yàn)操作
3.2.1?培養(yǎng)基制備按規(guī)定程序新鮮配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂（被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基）、玫瑰紅鈉瓊脂（被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基）以及酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基），滅菌后備用。
3.2.2?營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基取7個(gè)無(wú)菌平皿，分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各2皿，每皿接種1ml菌液（含菌50～100cfu），另一平皿不接種菌作為空白對(duì)照，傾注對(duì)照營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固后于30～35℃倒置培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)；被檢培養(yǎng)基同法操作。
3.2.3?玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基取5個(gè)無(wú)菌平皿，分別接種白色念珠菌、黑曲霉菌各2皿；每皿接種1ml菌液（含菌50～100cfu)，另一平皿不接種菌作為空白對(duì)照，傾注對(duì)照玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固后于倒置培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)；被檢培養(yǎng)基同法操作。
3.2.4?酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基取3個(gè)無(wú)菌平皿，分別接種白色念珠菌2皿，每皿接種1ml菌液（含菌50～100cfu），另一平皿不接種菌作為空白對(duì)照，傾注對(duì)照酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固后倒置培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)；被檢培養(yǎng)基同法操作。
3.3?結(jié)果判斷
若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70％，且菌落形態(tài)、大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致，則判斷該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。
4?控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查
控制菌檢查用成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配置的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。檢查項(xiàng)目包括培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)、指示和抑制特性能力。
4.1?計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查試驗(yàn)用菌株
大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]
乙型副傷寒沙門(mén)菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B) 50094]
銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B) 10104]
生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B) 64941]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]
菌株的培養(yǎng)及菌液制備同微生物限度檢查方法驗(yàn)證。
4.2?各種培養(yǎng)基需要測(cè)試的能力及判斷指標(biāo)
液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查：取不大于100cfu的試驗(yàn)菌分別接種于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃）及最短培養(yǎng)基時(shí)間下培養(yǎng)。增菌培養(yǎng)基多為澄清液體培養(yǎng)基，與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變渾濁。
固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查：取試驗(yàn)菌液0.1ml（含菌數(shù)50～100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃）及最短培養(yǎng)基時(shí)間下培養(yǎng)。
與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。
液體培養(yǎng)基指示能力檢查：取不大于100cfu的試驗(yàn)菌分別接種于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃）及最短培養(yǎng)基時(shí)間下培養(yǎng)。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)情況／指示劑反應(yīng)等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。
固體養(yǎng)基指示能力檢查：取試驗(yàn)菌液0.1ml（含菌不大于100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃）及培養(yǎng)基時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌的茵落形態(tài)特征、菌落顏色及指示劑反應(yīng)情況應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。
培養(yǎng)基抑制能力檢查：取不大于100cfu的試驗(yàn)菌分別接種于液體被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基，取試驗(yàn)菌0.1ml液（不大于100cfu）分別涂布于固體被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度（30～35℃）及最長(zhǎng)培養(yǎng)基時(shí)間下培養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。
4.3?控制菌檢查用培養(yǎng)基能力測(cè)試列表（表7）
控制菌檢查涉及的21種培養(yǎng)基，特點(diǎn)各異。表格中概述培養(yǎng)基檢查的具體項(xiàng)目，具體操作程序在其后說(shuō)明。
表7?控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查項(xiàng)目、菌株及判斷指標(biāo)
| 培養(yǎng)基 | 測(cè)試菌株 | 測(cè)試特性 | 測(cè)試指標(biāo) |
| 膽鹽乳糖培養(yǎng)基 | 大腸埃希菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 渾濁 |
| 銅綠假單胞菌 | 渾濁 | ||
| 金黃色葡萄球菌 | 抑制能力 | 未見(jiàn)渾濁 | |
| MUG培養(yǎng)基 | 大腸埃希菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 渾濁 |
| 大腸埃希菌 | 指示能力 | 366nm有熒光 | |
| 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂
或麥康凱瓊脂 |
大腸埃希菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 回收率 |
| 乙型副傷寒沙門(mén)菌 | 回收率 | ||
| 大腸埃希菌 | 指示能力 | 顏色形態(tài)同對(duì)照 | |
| 乙型副傷寒沙門(mén)菌 | 顏色形態(tài)同對(duì)照 | ||
| 乳糖膽鹽發(fā)酵管 | 大腸埃希菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 渾濁產(chǎn)氣 |
| 金黃色葡萄球菌 | 抑制能力 | 未見(jiàn)渾濁 | |
| 乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基 | 大腸埃希菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 渾濁 |
| 大腸埃希菌 | 指示能力 | 產(chǎn)氣 | |
| 營(yíng)養(yǎng)肉湯 | 乙型副傷寒沙門(mén)菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 渾濁 |
| 金黃色葡萄球菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 渾濁 | |
| 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基 | 乙型副傷寒沙門(mén)菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 上清渾濁 |
| 金黃色葡萄球菌 | 抑制能力 | 上清未見(jiàn)渾濁 | |
| 膽鹽硫乳瓊脂
或沙門(mén)、志賀屬瓊脂 |
乙型副傷寒沙門(mén)菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 回收率 |
| 乙型副傷寒沙門(mén)菌 | 指示能力 | 顏色形態(tài)同對(duì)照 | |
| 溴化十六烷基三甲銨
瓊脂 |
銅綠假單胞菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 回收率 |
| 大腸埃希菌 | 抑制能力 | 不得生長(zhǎng) | |
| 綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基 | 銅綠假單胞菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 回收率 |
| 銅綠假單胞菌 | 指示能力 | 顏色形態(tài)同對(duì)照 | |
| 亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基 | 金黃色葡萄球菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 渾濁 |
| 大腸埃希菌 | 抑制能力 | 未見(jiàn)渾濁 | |
| 卵黃氯化鈉瓊脂或
甘露醇氯化鈉瓊脂 |
金黃色葡萄球菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 回收率 |
| 金黃色葡萄球菌 | 指示能力 | 顏色形態(tài)同對(duì)照 | |
| 大腸埃希菌 | 抑制能力 | 不得生長(zhǎng) |
| 培養(yǎng)基 | 測(cè)試菌株 | 測(cè)試特性 | 測(cè)試指標(biāo) |
| 梭菌增菌培養(yǎng)基 | 生孢梭菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 渾濁 |
| 哥倫比亞瓊脂 | 生孢梭菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 回收率 |
| 沙氏葡萄糖肉湯 | 白色念珠菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 渾濁 |
| 沙氏葡萄糖瓊脂 | 白色念珠菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 回收率 |
| 白色念珠菌 | 指示能力 | 顏色形態(tài)同對(duì)照 | |
| 念珠菌顯色培養(yǎng)基 | 白色念珠菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 回收率 |
| 白色念珠菌 | 指示能力 | 顏色形態(tài)同對(duì)照 | |
| 白色念珠菌 | 抑制能力 | 不得生長(zhǎng) | |
| 1％聚山梨醋80-玉米
瓊脂培養(yǎng)物 |
白色念珠菌 | 促生長(zhǎng)能力 | 回收率 |
| 白色念珠菌 | 指示能力 | 顏色形態(tài)同對(duì)照 |
4.4?各控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查實(shí)驗(yàn)操作
控制菌檢查用培養(yǎng)基數(shù)量較多，特點(diǎn)各不相同。為了避免培養(yǎng)基配制過(guò)程出現(xiàn)遺漏，此處特別提示以下幾個(gè)需要特殊注意到培養(yǎng)基：
不可高壓滅菌只能加熱煮沸滅菌的培養(yǎng)基3種：DHL瓊脂、SS瓊脂和念珠菌顯色培養(yǎng)基；
需要添加試劑的培養(yǎng)基3種：TTB培養(yǎng)基、亞碲酸鹽肉湯和哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基。
以下敘述各培養(yǎng)基適用性檢查的具體操作過(guò)程：
4.4.1?膽鹽乳糖培養(yǎng)基?新鮮配制100ml／瓶的對(duì)照膽鹽乳糖培養(yǎng)基4瓶，121℃滅菌15min。備用。分別接種大腸埃希菌、銅綠假單胞菌以及金黃色葡萄球菌各1瓶，接種菌液量1ml（不大于100cfu），另一瓶不接種菌作為空白對(duì)照；被檢培養(yǎng)基同法操作，置規(guī)定溫度培養(yǎng)。培養(yǎng)18小時(shí)，與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變渾濁；培養(yǎng)48小時(shí)，空白培養(yǎng)瓶和接種金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)瓶應(yīng)不得渾濁；
4.4.2?MUG培養(yǎng)基新鮮配制5ml／支的對(duì)照MUG培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，備用。取3支，接種大腸埃希菌2支，接種菌液0.2ml（不大于100cfu），另一支不接種菌作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5小時(shí)。在366nm紫外光燈下觀察結(jié)果；被檢培養(yǎng)基同法操作，置規(guī)定溫度培養(yǎng)。空白培養(yǎng)管應(yīng)不得渾濁，且366nm處觀察無(wú)熒光；與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變渾濁，366nm處應(yīng)呈現(xiàn)熒光。若熒光不明顯，則可延長(zhǎng)至24h觀察。
4.4.3?曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）?新鮮配制對(duì)照EMB瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，冷卻至60℃傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取5個(gè)無(wú)菌EMB瓊脂平板，分別涂布接種大腸埃希菌和乙型副傷寒沙門(mén)菌各2皿，接種菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)18h，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及顏色應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；培養(yǎng)24h，空白平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。
4.4.4?麥康凱瓊脂培養(yǎng)基?新鮮配制對(duì)照麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，冷卻至60℃傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取5個(gè)無(wú)菌麥康凱瓊脂平板，分別涂布接種大腸埃希菌和乙型副傷寒沙門(mén)菌各5皿，接種菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)18小時(shí)，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及顏色應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；培養(yǎng)24小時(shí)，空白平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。
4.4.5?乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基?新鮮配制10m／支的對(duì)照膽鹽乳糖培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，備用。取5支，分別接種大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌，各2支，接種菌液1ml（不大于100cfu），另一支不接種菌作為空白對(duì)照；被檢培養(yǎng)基同法操作，置規(guī)定溫度培養(yǎng)。培養(yǎng)18h，與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變色、渾濁，且倒管中應(yīng)有明顯的產(chǎn)氣現(xiàn)象；培養(yǎng)24h，空白培養(yǎng)管和接種金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)管應(yīng)不得變色、不得渾濁。
4.4.6?乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基?新鮮配制10ml／支的對(duì)照乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，備用。取3支，接種大腸埃希菌2支，接種菌液1ml（不大于100cfu），另一支不接種菌作為空白對(duì)照；被檢培養(yǎng)基同法操作，置規(guī)定溫度培養(yǎng)。培養(yǎng)18h，與對(duì)照培養(yǎng)基比較．被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變色、渾濁，且有導(dǎo)管中應(yīng)有明顯的產(chǎn)氣現(xiàn)象；培養(yǎng)24h，空白培養(yǎng)管應(yīng)不得變色、不得渾濁。
4.4.7?營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基?新鮮配制100ml／瓶的對(duì)照營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3瓶，121℃滅菌15min，備用。分別接種乙型副傷寒沙門(mén)菌和金黃色葡萄球菌各1瓶，接種菌液1ml（不大于100cfu），另一瓶不接種菌株作為空白對(duì)照；被檢培養(yǎng)基同法操作，置規(guī)定溫度培養(yǎng)。培養(yǎng)18h，與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變渾濁；培養(yǎng)48h，空白培養(yǎng)瓶應(yīng)不得渾濁。
4.4.8?四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）?新鮮配制10ml／支的對(duì)照TTB培養(yǎng)基基礎(chǔ)，121℃滅菌15min，備用。臨用前，無(wú)菌操作加入0.2ml碘試液和0.lml亮綠試液。取5支，分別接種乙型副傷寒沙門(mén)菌和金黃色葡萄球菌各2支，接種菌液1ml（不大于100cfu），另一支不接種菌作為空白對(duì)照；被檢培養(yǎng)基同法操作，置規(guī)定溫度培養(yǎng)。培養(yǎng)18h，與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基上清渾濁；培養(yǎng)24h，空白的培養(yǎng)管和接種金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)管應(yīng)不得渾濁。
由于TTB中的碳酸鈣對(duì)渾濁現(xiàn)象觀察有影響，因此若渾濁現(xiàn)象不明顯，則將各培養(yǎng)物接種至膽鹽硫乳瓊脂（DHL）或沙門(mén)、志賀屬瓊脂（SS）平板上劃線觀察TTB培養(yǎng)物生長(zhǎng)情況，空白對(duì)照和接種金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)管劃線后應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)，對(duì)照和被檢TTB培養(yǎng)基劃線接種至瓊脂平板后應(yīng)有菌落生長(zhǎng)，且顏色形態(tài)一致。
4.4.9?膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基（DHL）?新鮮配制對(duì)照DHL瓊脂培養(yǎng)基，加熱充分溶解，冷卻至60℃傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取3個(gè)無(wú)菌DHL瓊脂平板，涂布接種乙型副傷寒沙門(mén)菌2皿，接種菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)18h，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及顏色應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；培養(yǎng)48h，空白平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。
4.4.10?沙門(mén)、志賀屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）?新鮮配制對(duì)照SS瓊脂培養(yǎng)基，加熱充分溶解，冷卻至60℃傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取3個(gè)無(wú)菌SS瓊脂平板，涂布接種乙型副傷寒沙門(mén)菌2皿，接種菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)18h，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及顏色應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；培養(yǎng)48h，空白平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。
4.4.11?溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)?新鮮配制對(duì)照溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，冷卻至60℃傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取7個(gè)無(wú)菌瓊脂平板，分別涂布接種銅綠假單胞菌和大腸埃希菌各3皿，接種菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)18h，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及顏色應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；培養(yǎng)24h，空白平板和接種大腸埃希菌的平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。
4.4.12?綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基（PDP）?新鮮配制對(duì)照綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基基礎(chǔ)，每升培養(yǎng)基中加入10ml甘油，121℃滅菌15min，冷卻至60℃傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取3個(gè)無(wú)菌綠膿菌素測(cè)定用瓊脂平板，涂布接種銅綠假單胞菌2皿，接種菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)24h；被檢培養(yǎng)基同法操作?？瞻灼桨鍛?yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及顏色應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致。
4.4.13?亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基?新鮮配制100ml／瓶的對(duì)照營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3瓶，121℃滅菌15min，備用。臨用加入新鮮配制的無(wú)菌1％亞碲酸鹽0.2ml。分別接種金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各1瓶，接種菌液1ml（不大于100cfu），另一瓶不接種菌株作為空白對(duì)照；被檢培養(yǎng)基同法操作，置規(guī)定溫度培養(yǎng)。培養(yǎng)18h，與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變黑、變渾濁；培養(yǎng)48h，空白培養(yǎng)瓶和接種大腸埃希菌的培養(yǎng)瓶應(yīng)不得渾濁。
4.4.14?卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基新鮮配制對(duì)照卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)，121℃滅菌15min，冷卻至60℃，參照2010版《中國(guó)藥典》比例無(wú)菌操作加入10％氯化鈉卵黃液，充分振搖后傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取5個(gè)無(wú)菌瓊脂平板，分別涂布接種金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各2皿，接種菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)24h，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及顏色應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；培養(yǎng)72h，空白平板和接種大腸埃希菌的平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。
4.4.15?甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基?新鮮配制對(duì)照甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，冷卻至60℃傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取5個(gè)無(wú)菌瓊脂平板，分別涂布接種金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌各2皿，接種菌液0.1ml（含菌50～1000fu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)24小時(shí)，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征及顏色應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；培養(yǎng)72h，空白平板和接種大腸埃希菌的平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。
4.4.16?梭菌增菌培養(yǎng)基?新鮮配制100ml／瓶的對(duì)照梭菌增菌培養(yǎng)基2瓶，121℃滅菌15min，備用。接種生孢梭菌1瓶，接種菌液1ml（不大于100cfu），另一瓶不接種菌株作為空白對(duì)照，置規(guī)定溫度的厭氧條件培養(yǎng)48h；被檢培養(yǎng)基同法操作?？瞻着囵B(yǎng)瓶應(yīng)不得渾濁；與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變渾濁。
4.4.17?哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基?新鮮配制對(duì)照哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，冷卻至60℃后傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取3個(gè)哥倫比亞瓊脂平板，涂布接種生孢梭菌2皿，接種菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后置規(guī)定溫度的厭氧條件下倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。48小時(shí)空白平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)，被檢培養(yǎng)基菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致。
哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，適宜多數(shù)需氧菌的生長(zhǎng)，為了消除其它雜菌生長(zhǎng)對(duì)檢查結(jié)果的影響，可在每升滅菌后培養(yǎng)基中按無(wú)菌操作添加含有相當(dāng)于20mg慶大霉素的硫酸慶大霉素。添加慶大霉素的哥倫比亞瓊脂可參照上述方法進(jìn)行培養(yǎng)基適用性考察。
4.4.18?沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基?新鮮配制100ml／瓶的對(duì)照沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基2瓶，121℃滅菌15min，備用。接種白色念珠菌1瓶，接種菌液1ml（不大于100cfu），另一瓶不接種菌株作為空白對(duì)照；被檢培養(yǎng)基同法操作，置規(guī)定溫度培養(yǎng)。培養(yǎng)48h，與對(duì)照培養(yǎng)基比較。被檢培養(yǎng)基中試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)基變渾濁；培養(yǎng)72h，空白培養(yǎng)瓶應(yīng)不得渾濁。
4.4.19?沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基?新鮮配制對(duì)照沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，121℃滅菌15min，冷卻至60℃后，傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取3個(gè)沙氏葡萄糖瓊脂平板，涂布接種白色念珠菌2皿，接種菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)24h，被檢培養(yǎng)基上的菌落大小、形態(tài)特征、顏色及氣味應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；培養(yǎng)72h，空白平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。
4.4.20?念珠菌顯色培養(yǎng)基?新鮮配制對(duì)照念珠菌顯色培養(yǎng)基，加熱充分溶解，冷卻至60℃傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。念珠菌顯色平板使用前避光保存，取5個(gè)無(wú)菌念珠菌顯色平板，分別涂布接種白色念珠菌和大腸埃希菌各2皿，接種0.1ml菌液（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)24h，被檢培養(yǎng)基上的菌落大小、形態(tài)特征及顏色應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；培養(yǎng)72h，空白平板和接種大腸埃希菌的平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。
4.4.21?1％聚山梨酯80－玉米瓊脂培養(yǎng)基?新鮮配制對(duì)照1％聚山梨酯80－玉米瓊脂培養(yǎng)基基礎(chǔ)，每升培養(yǎng)基中加入10ml聚山梨酯80，121℃滅菌15min，冷卻至60℃后，傾注平皿，35℃培養(yǎng)箱預(yù)培8h后備用。取3個(gè)1％聚山梨酯80－玉米瓊脂平板，涂布接種白色念珠菌2皿，接種菌液0.1ml（含菌50～100cfu），另一平板不接種菌作為空白對(duì)照，涂布均勻后于規(guī)定溫度倒置培養(yǎng)；被檢培養(yǎng)基同法操作。培養(yǎng)24h，被檢培養(yǎng)基菌落的大小、形態(tài)特征及芽管指示能力應(yīng)于與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；培養(yǎng)48h，空白平板應(yīng)無(wú)菌落生長(zhǎng)。
